Bilim insanı @Bilim_insani_835
Bilim insanı @Bilim_insani_835

Bitki Çalışmalarında Kullanmak için Golden Gate ile CRISPR İkili Vektörü (Binary Vector) Oluşturma

Tomáš Čermák ve arkadaşları 2017 yılında Plant Cell dergisinde yayınladıkları ''A Multipurpose Toolkit to Enable Advanced Genome Engineering in Plants'' başlıklı çalışmada monokot ve dikot bitkilerde kullamılmak üzere çeşitli genom mühendisliği yaklaşımları kullanılarak hedefli ve spesifik olarak değiştirilmeye uygun kapsamlı bir golden gate klonlama yöntemi sunmuşlardır. Transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazları (TALENs) ve kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/Cas9 sistemi baz alınarak geliştirilen sistem, hızlı ve modüler klonlama için sistematize edilmiştir. Geliştirdikleri vektörler, tek veya çoklu gen nakavtları ve büyük kromozomal silmeler oluşturacak şekilde optimize edilmiştir. Ayrıca, geminivirus bazlı vektörlerin entegrasyonu, homolog rekombinasyon yoluyla hassas gen düzenlemesini mümkün kılmaktadır. Geliştirilen sistemle transkripsiyonun düzenlenmesi de mümkündür. Web tabanlı bir araç (Webtools for the Voytas Lab Plant Genome Engineering Toolkit, http://crispr-multiplex.cbs.umn.edu//), vektör seçimi ve yapımını kolaylaştırmaktadır. Yaptıkları platformun bir avantajı, aynı anda birden fazla kılavuz RNA (gRNA) eksprese etmek için Csy-tipi (CRISPR sistemi yersinia) ribonükleaz 4 (Csy4) ve tRNA işleme enzimlerinin kullanılmasıdır. Örneğin, tek bir transkriptten 12 gRNA eksprese ederek altı gene kadar hedefli delesyon mutasyonları yapılabilir. Csy4 ve tRNA ekspresyon sistemleri, bireysel RNA polimeraz III promotörlerinden eksprese edilen gRNA'lardan neredeyse iki kat daha etkilidir. Mutagenez, Trex2 eksonükleazın dahil edilmesiyle 2,5 kat daha da artırılabilir. Son olarak, Cas9 nickazlarının, geminivirus replikonları üzerinde taşındıklarında, doğal Cas9 ile karşılaştırılabilir frekanslarda gen hedeflemeyi indüklediğini göstermişlerdir. Reaktifler, domates (Solanum lycopersicum), tütün (Nicotiana tabacum), Medicago truncatula, buğday (Triticum aestivum) ve arpa (Hordeum vulgare) bitkilerinde başarıyla doğrulanmıştır.