Bilim insanları genom analizleri yapılmaya başlandıktan sonra prokaryotlarda kısa tekrarlı dizilerin varlığına rastlamıştır. Prokaryotların genomlarının karşılaştırılması sonucunda bu tekrar dizilerinin korunmuş ve benzer olduklarını fark etmişlerdir. Biyolojik rolleri anlaşılamasa da, gen evriminde ve gen ekspresyonunda fonksiyonlarının olabileceği düşünülmüştür (Gilson ve ark., 1984). 21-47 bp’den oluşan ve en az 14 kere tekrar eden genoma yerleşmiş bu kısa dizi tekrarları (SSRs), ‘spacer’ olarak adlandırılan tekrar etmeyen palindromik diziler ile ayrılmışlardır.

Birçok araştırmaya konu olan bu dizi tekrarları ve spacerlar; SRSR-short regularly spaced repeats (Mojica ve ark., 2000), LCTR-large cluster of 20 nt tandem repeat seguence (She ve ark, 2001), SPIDR-spacer ınterspersed direct repeat (Jansen ve ark., 2002a) olarak adlandırılırken Jansen ve ark., 2002’de CRISPR-clustered regularly interspaced short palindromic repeats (Jansen ve ark., 2002b) tanımlaması yaparak günümüzde kullanılan adını vermişlerdir.

Mojica ve ark., yaklaşık 4500 tane CRISPR ‘spacer’ları kullanarak yaptıkları çalışmada yabancı DNA’lar (kromozomlar, bakteriyofaj genomlar, konjugatif plazmitler vb.) ile ‘spacer’ların yüksek derecede benzerlik gösterdiklerini bulmuşlardır (Mojica ve ark., 2005). Streptococcus thermophilus suşlarının fajlar ile enfekte edilmesi sonucu, virüsten kaynaklanan yeni spacer’ların diğer spacer kümesine insersiyonu ile bu fajlara dirençli hale gelmiştir (Barrangou et al., 2007). Bu bulgular prokaryotlarda enfeksiyona neden olan ajanlar için bir savunma sistemi olduğunu göstermiştir.

Yabancı DNA’lar prokaryot genomuna spacer olarak rastgele yerleşmezler. Bu DNA’larda bulunan ve cas nükleazının tanıyıp kesim yaptığı PAM (protospacer associated motif) dizisi tanınır ve spacer olarak hangi yönde yerleşeceği belirlenir (Mojica, 2009). Yeni eklenen spacerlar CRISPR lokusunun öncül dizisi olarak adlandırılan uzun tekrar dizisinin hemen arkasına eklenir. Bu da spacer’lara bakarak o organizmanın sırayla hangi fajlar tarafından enfekte edildiği anlayabilmemizi sağlar (Deveau, 2008).

Bu savunma sistemi araştırılırken, Streptococcus thermophilus’da bulunan dizi tekrarlarının yakınlarında CRISPR-associated (Cas) adı verilen genler keşfedilmiştir. Bu genlerin fonksiyonlarını araştırmak için Cas5 ve Cas7 olarak tanımladıkları genlerin inaktivasyonunu sağlamışlardır. Cas7 geninin susturulması sonucu dirençliliğin bozulmadığını, bu genin spacer’ları eklemek için görev aldığını ve Cas5 (günümüzde Cas9 olarak biliniyor) geninin sustuğunda dirençliliğin ortadan kalktığını bulmuşlardır. HNH-tip nükleaz motifinin bulunması Cas9’un savunma sisteminde nükleaz olarak görev aldığını göstermiştir (Barrangou, 2007).

Cas nükleazlarının virüs DNA’sına hedeflenmesi ise bir rehber RNA ile gerçekleşir. CRISPR lokusundan sentezlenen öncül RNA, RNase III enzimi ile iki RNA olacak şekilde kesime uğratılır. Bu RNA’lar trans-activating crRNA (tracrRNA) ve CRISPR RNA (crRNA) olarak adlandırılırlar. Spacer ve yanında ki tekrar dizilerinden oluşan bu öncül RNA, kesildikten sonra tracrRNA ve crRNA olarak Cas nükleazına rehberlik eder (Brouns, 2008).

Şekil 1. CRISPR savunma sisteminin gerçekleşmesi.

Cas9 proteinin yaygın kullanılmasının nedeni, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pyrococcus furiosus ve  Streptococcus thermophilus’da ki Cas protein sistemleri karşılaştırılmasıdır. S.thermophilus’da bulunan Cas9 proteinin tek başına mutasyon oluşturmada etkili olduğu gösterilmiş ve bundan sonra yapılan çalışmalarda Cas9 proteini tercih edilmiştir (Siksnys, 2011).

Cas9 proteini kristalize edilerek 3 boyutlu yapısı incelendiğinde iç yüzeyinin pozitif aminoasitler ile çevrili olduğu bulunmuştur. NUC (nuclease) lobunun RuvC, NHN ve PI (PAM-interacting) domainlerini, REC (recognition) lobununun da REC1, REC2 ve Bridge heliks domainlerini içerdiklerini göstermişlerdir. RuvC domaini hedef DNA’nın komplementer olmayan zicirini keser, HNH domaini ise komplementer zinciri keser. REC lobunu başka işlevsel bir loba benzetemedikleri için ‘Cas9-spesifik fonksiyonel domain’ olarak adlandırmışlardır. REC2 domainindeki değişikliklerin gRNA’yı bağlamada bir etkisinin olmadığını ve herhangi bir bağ kurmadığını göstermişledir (Nishimasu ve ark., 2014).

Jinek ve ekibi, 2012 yılında tracrRNA ve crRNA’yi tek kimerik RNA-rehber RNA olarak birleştirerek spesifik genlerde double strand DNA kesikleri meydana getirmişlerdir. Böylece bu immün sistemin bir genom düzenleme aracı olarak kullanılmasında ilk adımları atmışlardır (Jinek, 2012).

Dizayn

S. pyogenes Cas9 proteini ile diğer ortolog Cas9 proteinlerinin PI domainleri karşılaştırdıklarında farklı PAM sekanslarına spesifitileri olduğu keşfedilmiştir. sgRNA’nın tetraloop ve repeat:antirepeat bölgelerinin önemine değinmişlerdir. Cas9 proteinine bağlanan sgRNA’nın 20 nükleotidi hedef DNA ile eşleştikten sonra bir cap ekler ve keser, bu yüzden 20 nükleotidden fazla olan rehber RNA’ya gerek kalmaz. Cas9’nın REC1 ve RuvC domainleri DNA ve RNA arasındaki farkı ayırt ederek DNA’ya bağlanmasını sağlarlar (Nishimasu ve ark., 2014).

PAM sekansının Cas9 aktivasyonu için önemini aydınlatan bir çalışmada, Cas9 proteinin ve rehber RNA’nın DNA’ya bağlanmasında PAM sekansı ile ilgili bir model önerilmiştir. Cas9 proteininde bulunan Arg333 ve Arg1335 tarafından sekans spesifik PAM ile etkileştiği gibi hedef dizilerdeki +1 fosfat grubuyla da etkileşmektedir. Bu Cas9-RNA komleksi PAM sekansının hemen üzerindeki nükleotitlerin DNA’yı tanımasına izin verir. Bu nedenle PAM, DNA-RNA heterodubleks yapısının oluşması ve ayrılması için anahtar yapıdadır (Anders ve ark., 2014).

Zhang ve ark. Cas9 nükleaz aktivitesinin nasıl susturulacağı ile ilgili bir çalışma yapmışlardır. Ayrıca sgRNA dizaynında önemli noktalara değinerek, NHEJ ve HDR-bazlı genom modifikasyonları oluşturmuşlardır. Cas9 nükleazının katalitik domaini RuvC domaininde asparatın alanine dönüştürülmesiyle (D10A) tek bir DNA zincirini kesen mutant nickase Cas9 (Cas9n) oluşturarak, wild tipe (WT) Cas9 ile karşılaştırmışlardır. HEK293T ve insan kök hücre hattı HUES9 hücre hatlarında test edilerek Cas9n doğrulanmıştır. Ayrıca sgRNA dizaynında PAM sekansının 5’ ucunda bulunması ve 20 nt olması gerektiğinine değinmişlerdir (Cong ve ark., 2015).

sgRNA’nın stem-loop 1 ve 3 yapısı Cas9 ile bağlantı kurar, tetraloop ve stem-loop 2 ise hiçbir etkileşime girmez ve Cas9-sgRNA kompleksinin dışında kalır. Bu özelliği kullanarak tetraloop ve stemloop 2’ye MS2 (proteinin bağlandığı RNA dizisi) eklemişlerdir. Daha sonra bu MS2’ye bağlanan p65, HSF1 ve VP64 transaktivatör domainlerini farklı kombinasyonlarda ve sayılarda Cas9-sgRNA kompleksi ile birleştirmişlerdir. SAM (synergistic activation mediator) ile proksimal promotera hedeflenen sgRNA’in daha yüksek aktivasyon oluşturduğunu belirtmişlerdir. SAM kullanarak dizayn edilen tetraloop ve stem-loop 2’de MS2 bulunan sgRNA, MS2-p65-HSF1 ve NLS-dCas9-VP64 kombinasyonunun en iyi etkili transkripsiyonal aktivasyon sistemi olduğunu bulmuşlardır. Neurog2 geninde, dCas9 ve sgRNA’ye eklenen MS2-VP64 ‘nın oluşturduğu aktivasyonunun, değiştirilmeyen sgRNA-dCas9-VP64 aktivasyonundan 12 kat daha fazla olduğunu göstermişlerdir (Konermann ve ark., 2015).

Yaygın olarak kullanılan Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)’a alternatif olarak Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9)’ı kullanıldığında spesifikliğin arttığı tespit edilmiştir. Bu çalışmada tek bir AAV (adeno-associated virus) vektörüne aktarılan SaCas9 ve sgRNA ile fare karaciğerinde bulunan kolesterol düzenleyen Psck9 geni hedef alınmıştır. Vektör fareye kuyruk veninden enjeksiyonla verilerek ilk haftada kolesterol düzeyinde yaklaşık %40 oranda azalma gözlenmişlerdir. Ayrıca Cas9 proteininin boyutunun küçüldükçe verimliliğin artacağını göstermişlerdir. İn vivo ortamda 6 tane karakterize edilmiş Cas9 ortoloğu (P.lavamentivorans, C.diphtheuriae, S.pasteurianus, N.cinerea, C.lari, S.thermophilus) ve SaCas9 proteinini daha büyük olan SpCas9 ile karşılaştırarak aralarında boyutu daha küçük olan SaCas9 proteininin, AAV ile aktarmada verimliliğinin yüksek olduğunu göstermişlerdir (Ran ve ark., 2015).

Zhang ve ark. mikrobiyal adaptif immün sisteminin bir üyesi olan Cas9’a benzer yeni bir protein olan ve yaklaşık olarak 1300 amino asitten oluşan Cpf1’ı keşfettiler. 16 tane Cpf1 ailesi dışında Acidaminococcus ve Lachnospiraceae’dan izole edilen Cpf1 proteinin insan genom düzenlenmesinde efektif bir şekilde kullanılabileceğini gösterdiler. Keşfettikleri bu proteinin tıpkı cas9 gibi RNA rehberliğinde DNA’ya hedeflendiği ve hedef bölgede kesim yapılabilecek bir endonükleaz aktivitesi olduğu bulmuşlardır. Yapılan çalışmada bu benzerliklerin aksine Cpf1 proteni ile Cas9 proteini arasında bazı önemli farklar olduğuna değinmişlerdir. Cas9 proteininin DNA’ya hedeflenebilmesi için gerekli olan rehber RNA crRNA ve tracrRNA’dan oluşur, fakat Cpf1 proteininin hedeflenebilmesi için olgun crRNAlar tracrRNA’lara ihtiyaç olmaksızın çalışabilir. Cas9 proteininin kullanıldığı sistemde Guanin bakımından zengin bir PAM sekansı kullanılırken Cpf1 proteininin kullanıldığı sistemde Timin bakımından zengin bir PAM sekansı kullanılır. Cas9 proteini kesim sonucunda DNA’da küt uçlu bir yapı oluştururken, Cpf1 proteini ise 4-5 nükleotidlik bir yapışkan uç oluşturur (Zetsche ve ark., 2015).

Şekil 2. Cpf1 ve Cas9 mekanizmalarının karşılaştırılması.

MUTASYON

Kromozamal yeniden düzenlemeler genellikle füzyon gen ekpresyonunun sonucudur. İnsan NSCLC (non-small cell lung concers) hastalığında keşfedilen Eml4 ve Alk genlerinin füzyonu ile oluşan kromozomal yenileme in vivo ortamda Cas9 kullanarak oluşturulmuştur. Fare NIH/3T3 hücrelerinde kromozomal 17’de bulunan Eml4 ve Alk genlerinde çift DNA kırıkları oluşturulmuş ve Emlk-Alk füzyon transkriptinin dizilenmesi yapılarak doğrulanmıştır. Fare de ise Eml4-Alk fusion gen sonucu oluşan karaciğer kanseri oluşturulmuştur. Böylece Cas9 sistemi kullanılarak delesyonlar, inversiyonlar ve kromozoml translokasyonlar oluşturulabildiği gösterilmiştir (Maddalo ve ark., 2014).

mESC hücrelerinde Cas9 mRNA’yı ve sgRNA verilerek  Tet (Ten-elevan translocation) genleri Tet1, Tet2, Tet3 ayrıca Uty ve Sry genlerinin 8 alelinde %10 oranında mutasyon oluşturulduğu, çeşitli kesim enzimleri ile RFLP yapılarak gözlenmiştir. Ayrıca fare zigotlarına verilen Cas9 proteini, Tet1 ve Tet2 genleri için tasarlanmış sgRNA ile her iki gende HDR (mutant oligolar ile) ve NHEJ aracılığı ile bilalelik mutasyonlar oluşturmayı başarmışlardır. Bu zigotlardan oluşan farelerde tet genleri bakımından heterozigot ve homozigot oldukları gözlenmiştir (Wang ve ark., 2013).

Streptococcus Pyogenes SF370 Tip2 CRISPR siteminin memeli kromozomlarında çift zinciri kesebilen nükleaz aktivitesi olduğu gösterilmiştir. Nüklear Lokalizasyon Sinyali (NLS) eklenmiş ve kodon optimize edilmiş S. Pyogenes (spCas9), RNase 3 (SpRNase3) kullanılmıştır. Oluşturulan Cas9 proteinini DNA ya hedeflemek için tracrRNA ve insan EMX1 genine özgü dizayn edilmiş crRNA ve NGG üçlü nükleotitten oluşan PAM sekansı tasarlanmıştır.

Sonuç olarak Cas9 proteini, PAM motifi (NGG), tracrRNA ve precrRNA füzyonuyla oluşturulmuş bir sistemin insan kromozomlarını kesmek için yeterli olduğu görülmüş ve spRNase’ın sistemin çalışması için gerekli olmadığı gözlenmiştir (Ran ve ark., 2013).

AKTİVASYON

Nükleaz aktivitesi deaktive edilmiş S. pyogenes Cas9 proteini 20 baz uzunluğunda bir rehber RNA eşliğinde Escherichia coli (E. coli)’ye aktarılmıştır. Cas9 proteinin katalitik domaininde yapılan aminoasit değişiklikleri nükleaz aktivitesinin kalkmasını sağlamıştır; H840A ve D10A. Bu çalışmada bazı genler ve seçilmiş bazı operonlara spesifik rehber RNA dizayn edilmiş ve nükleaz aktivitesi susturulmuş cas9 (dCas9) ile gen spesifik bir susturma işlemi yapılabildiğini göstermiştir. Yapılan çalışmada dCas9 proteinin RNA polimerazın ilerlemesini engellediği dolayısıyla transkripsiyonun baskılandığı gözlemlenmiştir. Bu yöntemle Gen knock-out işleminden farklı olarak E.coli kromozomunun nükleotit dizilerinde bir değişiklik olmadan hedeflenen genin ifadesi susturulmuştur. dCas9 ile Gen knock-down yapılabilen bu sisteme iCRISPR adı verilmiştir. Bakterinin doğal transkripsiyon sistemi, bu yöntemle geri dönüşümlü olarak susturulabilmiştir. Bu çalışmada aynı anda birden fazla genin transkripsiyonu baskılandığından bakterilerde çoklu gen susturması da yapılabileceğini göstermiştir. PAM sekansı uyumu ve bunu takip eden 12 bazlık bir gRNA spesifikliği bu susturmanın verimini belirlediği gözlemlenmiştir. Bu çalışmayla gRNA yardımıyla genlerin spesifik bir şekilde hedeflenebileceği ve dCas9 ile transkripsiyonun baskılanabileceği gösterilmiştir (Qi ve ark., 2013).

Gen düzenleme ve hücrelerin yeniden programlanması sırasında genlerin aktivasyonu ve baskılanması için hassas yöntemler kullanılmalıdır. Streptococcus Pyogenes dCas9 proteini RNA rehberliğinde DNA’ya hedeflenebilir. Saccarayomces Seravies ve insan HEK293T hücrelerinde dCas9 sistemine VP64, p65AD Aktivatör domain veya CRAB ( Krüpper Associated Box), WRPW ( Trp-Arg-Pro-Trp) gibi represör domainleri, efektör proteinler eklenerek oluşturulan füzyon proteiniyle gen düzenleme yapıldı. RNA-seq analizleri sonucu mantar ve insan hücrelerinde CRISPRi sistemiyle gen spesifik aktivasyon-represyon yapılabildiği gösterilmiştir (Mali ve ark., 2013).

dCas9 proteinin C-terminaline VP48 transaktivatör domaini eklenmiş ve transksipsiyonel aktivasyon ekzogenik raportör gen tdTomato ve tetracycline-inducible promotör aracılığı ile test edilmiştir. Doxycycline yokluğunda insan HeLa hücrelerine dCas9-VP48 transfekte edildiğinde gözlemlenen tdTomato ekspresyonu ile ortama doxycycline eklendikten sonra gözlemlenen tdTomato ekspresyonun aynı olduğu saptanmıştır. Bunun yanında HEK293T hücrelerinde bulunan endogenik IL1RN, Oct4 ve Sox2 genleri için dizayn edilen sgRNA ile dCas9 hücreye transfekte edilmiş, hedeflenen genlerdeki transkripsiyonel aktivasyonunda 4-8 kat artış olduğu gözlemlenmiştir. Ayrıca sgRNA/dCas9-VP160 kompleksinin transcriptional start site (TSS)’nin 300bp yukarısına bağlanmasının gen aktivasyonunda verimi arttırdığını göstermiştir. Fare zigotunda Nanog promotörü hedeflenerek in vivo ortamda gen aktivasyonu test edilmiştir. Nanog:EGFP plazmit olarak fare embriyolarına verilmiş ve GFP ekspresyonu göz önüne alınarak aktivasyonun 4. günde arttığı tespit edilmiştir (Cheng ve ark., 2013).

Church ve ark., dCas9-VP64’ün C-terminaline p65 ve Rta transkripsiyonal aktivatör domainlerini eklemiş, oluşturulan bu hibrit proteini dCas9-VP64-p65-Rta (dCas9-VPR) olarak tanımlamışlardır. Farklı genler için dizayn edilen 4 farklı gRNA ve dCas9-VPR ile HEK293T hücreleri transfekte edilmiş ve transfeksiyon sonucunda çeşitli endogenik genlerin ekspresyonunda artış olduğu göstermişlerdir. Aynı yöntemle kodlanan ve kodlanmayan endogenik genlerin aktivasyonu ile indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin nöronal farklılaşması hedeflenmiştir. Bu çalışma sonucunda dCas9-VPR kullanılan hücrelerdeki transkripsiyonel aktivasyonun dCas9-VP64 kullanılanlara oranla 22-320 kat artış gözlemlenmiştir (Chavez ve ark., 2015).

Birçok çalışmada transkripsiyonel aktivatör, represör ve diğer düzenleyicilerin dCas9 proteinine eklenebildiği ve bu yöntemle transkripsiyonel aktivasyon ya da baskılama yapılabileceği gösterilmiştir. Bundan farklı olarak, Zalatan ve ark., maya ve insan HEK293T hücrelerinde yaptıkları deneylerde dCas9-RNA kompleksindeki dCas9 yerine sgRNA iskele yapısına RNA-bağlayıcı proteinleri ekleyerek bu yapıyı modifiye etmiştir. İskele RNA (scaffold RNA, scRNA) adını verdikleri bu yapıya protein bağlayabilen MS2, com ve PP7 domainleri eklenmiş, ve bu domainlere bağlanabilen MCP(MS2 coat protein), com(RNA bağlayan protein) ve PCP(PP7 coat protein) gibi proteinlere VP64 transaktivatör domaini eklenerek, hazırlanan dCas9-RNA-düzenleyici grup kompleksiyle transkripsiyonel aktivasyon yapılmıştır. Yapılan deneyler sonucunda scRNA aracılığıyla eklenen VP64 ile yapılan transkripsiyonel aktivasyon veriminin dCas9-VP64 ile yapılan aktivasyona göre daha fazla olduğu gözlemlenmiştir (Zalatan ve ark., 2015).

HÜCRE İÇİNE AKTARMA

Birden fazla gRNA ile yapılan çalışmalarda her bir gRNA için ayrı vektör kullanmak transfeksiyon ve buna bağlı olarak genin manüpülasyon verimini düşürdüğünü gözlemlenir. Sakuma ve ark, bu verimi arttırmak için Golden Gate klonlama metodu kullanarak bir pX330 vektörüne 7 gRNA ve Cas9 nükleazını klonlamayı başarmışlardır. Hazırlanan bu vektör HEK293T hücrelerine transfekte edilmiş ve APC genindeki manupulasyonu test etmişlerdir. 7 gRNA’nın bir vektör ile ve teker teker vektörler ile aktarılmasının canlı sistemde ki mutasyon oluşturma verimliliğinin aynı olduğu gösterilmiştir (Sakuma ve ark., 2014).

Taşıma aracı olarak bir lentiviral vektör kullanıldığında ise vektöre; dCas9-VP64 protein füzyonu, dört faklı DNA hedefi için hazırlanmış rehber RNA ve GFP raportör geni, Golden Gate yöntemiyle aktarılmıştır. Çalışmanın sonuçları incelendiğinde; hazırlanan vektörün, HEK239T primer hücre kültüründe transdiksüyon yapabildiği, istenilen gen bölgesinin hedeflenebildiği ve uzun süreli gen aktivasyonunu sağlayabildiği gözlemlenmiştir (Kabadi ve ark., 2014).

Mutant fare oluşturmak için yapılan çalışmalarda, gerekli olan endonükleazı kodlayan vektör ve dönor DNA mikroenjeksiyonla hücre içerisine aktarılır. Bu süreç oldukça zahmetli bir işlem olduğundan dolayı hem verimi düşük, hem de genetik analizlerin sonucu oldukça zaman almaktadır. Yapılan çalışmada Cas9 RNA’sı ve fare Fgf10 genini hedef alan rehber RNA’lar elektroporasyon ile hücrelere transfekte edilmiş ve çalışma sonucunda efektif bir şekilde knock-in yapılabildiği gözlemlenmiştir. Elektroporasyon yönteminin mikroenjeksiyon yöntemine göre daha kolay uygulanabilir olması mutant fare üretimini kolaylaştırmış ve geniş çaplı bir genom düzenleme yapılabileceği gözlemlenmiştir (Hashimoto ve ark., 2015).

Başka bir çalışmada nükleik asitlerin taşınmasında kullanılan katyonik ajanların (RNAimax, Lipofectamine 2000 vb.) protein taşınmasında da etkili olduğunu göstermişlerdir. Cas9 proteini, yüksek negatif yüklü olan GFP ile birleştirilerek in vivo ve in vitro ortamlara katyonik ajanlar aracılığıyla hücre içine verilmiştir. Plazmit transfeksiyonuna oranla 10 kat daha fazla genom modifikasyonu ve ayrıca genom modifikasyonunda in vivo ve in vitro ortamlarda %20 oranında artış gözlenmiştir (Zuris ve ark., 2015).

VERİM VE SPESİFİKLİK

Kodon optimize edilmiş S. pyogenes Cas9 proteini ile 20 nükleotit uzunluğunda crRNA ve tracrRNA füzyon RNA’sı ve PAM sekansıyla (5’-NGG-3’) hazırlamış CRISPR sistem ile CRISPR hedeflenme spesifikliği araştırılmıştır. 700 farklı gRNA varyantı ile 293T ve 293FT hücre hatlarında gen-spesifik çalışma yapılmıştır. Bu çalışmalarda 100 tane hedef dışı lokus ve in-del mutasyonlar tespit edilmiştir (Hsu ve ark., 2013).

Transkripsiyonal aktivasyon için dizayn edilen dCas9-sgRNA kompleksi ile 18 mer TAL-efektor proteinlerinin hedef-dışı bağlanma oranlarına bakılmıştır. Bu oranların sırasıyla 1-3 ve 1-2 hedef uyuşmazlıklarını tolere edebildiklerini böylece Cas9-sgRNA sisteminin hedef dizide çoklu uyuşmazlıları yüksek oranda tolere edebildiğini gösterilmiştir. Ek olarak endogenik Oct4, Sox2, Rex1 aktivitesini dCas9-VP64 ve sgRNA’ye eklenen MS2-VP64 kompleklerini kullanarak 1,5-3 kat arttırmışlardır (Mali ve ark., 2013).

SV40 NLS (Nüklear Lokalizasyon Sinyali) eklenmiş  S.Pyogenes Cas9 proteini ile 23 nükleotit uzunluğunda iki farklı crRNA (GN₂₀GG) ve tracrRNA füzyon RNA’sı ve PAM sekansıyla (5′-NGG-3^‘) hazırlamış CRISPR’ın insanlarda gen mühendisliği araştırılmıştır.

Yapılan çalışmada endogenius bir gen olan AAVS1 lokusu hedeflenmiş ve tranfeksiyon verimleri 293T hücreleride %25, K562 hücrelerinde %8 ve İPSC’ lerde %2-4 olduğu gözlendi. Yapılan çalışma sonucunda CRISPR sisteminin insan kromozomlarında iyi çalışabilmesi için PAM sekansının dizi eşleşmesinin önemli olduğunu ve PAM sekansını takip eden rehber RNA’da ki 8-12 baz uzunluğunun çok önemli olduğunu ve bu sekansa ‘’çekirdek sekansı’’ tanımı yapılmıştır. Farklı gRNAların farklı verimlerde sistemi çalıştırdığı gösterildi. Bakterilerde yapılan çalışmalar 5′ ucun tolere edilebileceğini göstermiştir. Aynı zamanda CRISPR spesifikliği için hedef lokusun kromatin yapısının önemli olduğu gösterilmiştir. Bu çalışma sonucunda elde edilen verilerden yararlanarak biyoinformatik analizler yapılmıştır. Bu analizler sonucunda insan genomunda ekzonların %40’ını hedef alabilen yaklaşık olarak 190.000 gRNA varyasyonu olabileceğini gösterilmiştir (Mali ve ark., 2013).

Bir başka verimlilik için yapılan çalışmada kodon optimize edilmiş  S. pyogenes Cas9 sistemi kullanılarak 6 tane fare, 3 tane insan geni için hedefleme ve Cas9 aktivitesi test edilmiştir. Fare EL4 hücreleri (timik hücre hattı) hazırlanan sgRNA havuzuyla transfekte edilerek fare hücreleri transfeksiyondan 9 gün sonra spesifik hücre yüzey markırları ile verim test edilmiştir. Aynı çalışmalar MOLM13, NB4 ve TF1 insan hücre ise transfeksiyondan 8 gün sonra FACS ( Floresan Aktive Edilmiş Cell Sorting) yöntemiyle; fare için gen başına 61-157, insan için 116-256 sgRNA test edilmiştir. Bu çalışmada binlerce sgRNA test edilerek gen hedefleme, DNA kesimi, Null Alllel oluşturma verimleri incelenmiştir. Bunun yanında RNAi benzeri bir yaklaşım olarak CRISPRi sistemi kullanıldı. Bir genin bialellik oluşu mutasyonun her zaman fenotipe yansımasını engelleyebilir. Bu çalışma ile alleller hedeflenebileceğinden genin fenotipteki yansıması incelenebildiğini ve protein düzeyinde tayin yapılabildiğini göstermiştir.

Hem fare hem insan için 4 hücre hattı ve 9 gen için hazırlanan sgRNA sonuçlarından yola çıkılarak 414 önemli gen için alternatif sgRNA veri tabanı hazırlanmıştır. Sonuç olarak hedefleme aktivitesi yüksek, efektif crRNA için veri tabanı hazırlanmış olmuştur (Doench ve ark., 2014).

KULLANILAN ALANLAR

Fonksiyonel olan protein domainlerini kodlayan ekzonlar için 70’in üzerinde rehber RNA tasarlanarak S. pyogenes CRISPR sistemi ile kesim yapılmış ve genlerin aktivasyonunu yok ederek fenotipteki etkileri araştırılmıştır. Bu yöntemle kanserle ilişkili olduğu düşünülen genler, gen-spesifik rehber RNA’lar ile hedeflenmiş ve bu genlerin kanser ile bağlantısı hakkında, ayrıca farmokolojik özellikleri hakkında bilgi edinilmiştir.

Önemli büyük multi-domain proteinler ve bunun yanında Rpa3 gibi küçük proteinlerin etkilerinin araştırılması için efektif bir yöntem olduğu gösterilmiştir. Bunun yanında enzimatik reaksiyonlar için tanımlı olan protein-preotein etkileşimler ve enzim-ilaç ilişkilerini tanımlamak için gerekli olan farmokolojik proteinler için bir koleksiyon oluşturulmuştur (Shi ve ark., 2015).

Hücrenin yaşayabilmesi için kanser ve pluripotent kök hücrelerinde olan esas genler genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out (GeCKO) kütüphanesini kullanarak bulunmuştur. Tek bir lentiviral vektöre Cas9, bir sgRNA aktarılarak HEK293T hücrelerine verilmiştir. Aynı çalışmada melonoma hücre hattı A375 ve insan kök hücre hattı HUES62 hücrelerinde NF1, NF2, MED12, CUL3, TADA1, TADA2B genleri farklı sgRNA’lar dizayn edilerek susturulmuştur. Her bir gen için 3-4 sgRNA dizayn edilmiş ve birbirinden farklı bu sgRNA’ lerin aynı geni hedefleme oranlarının yüksek uyumluluk gösterdiğini belirtmişlerdir (Shalem ve ark., 2014).

Hedeflenen nükleaz aktivitesinin GFP bozulmasına dayanan bir metod kullanarak hızlı ölçülmesini sağlamışlardır (Human cell-based enhanced green fluorescent protein –EGFP- distruption assay ). Entegre olmuş ve ölçülebilr EGFP reportör genine sahip insan U20S.EGFP hücrelerinde floresan sinyalinin kaybolmasıyla hedef ve hedef dışı mutasyonlar tespit edilmiştir. İnsan hücrelerinde gRNA ve Cas9 aracılığıyla yapılan mutasyonların endogenik genlerde 6 hedeften 4’ünün hedef dışı mutasyon olduğunu göstermişlerdir. Ayrıca CRISPR RNA –guided endonucleases (RGENs) eksik RNA-DNA eşleşmesinde bile yüksek derecede aktif olduğunu da göstermişlerdir (Fu ve ark., 2013).

Şekil 3. CRISPR ile genom lokusunun görüntülenmesi

GFP, floresan ışık altında yeşil ışık yaydığından dolayı çalışmalarda marker olarak kullanılmaktadır. dCas9 proteinine GFP proteinini ekleyerek oluşturulan bir füzyon proteini (EGFP-tagged endonuclease-deficient Cas9 protein) rehber RNA yardımıyla spesifik nükleotid dizilerine hedeflenmiştir. Bu sistemle canlı hücrelerde kromatin domainleri ve hedeflenen lokusların yapı ve fonksiyonu gözlemlenmiştir (Chen ve ark., 2013).

Nihongaki ve ark., ışık ile uyarılabilir Cas9 ( paCas9 – photoactivatable Cas9) dizayn ederek, insan hücrelerinde CRISPR-Cas9 sistemin çalışması ve buna bağlı olarak ışık ile uyarılmış gen düzenlenmesini optogenetik alanında literatüre yeni bir yöntem olarak kazandırmışlardır. paCas9 olarak adlandırdıkları bu sistem, Cas9 fragmentleri ve bunlarla eklenmiş Magnet adı verilen ışıkla uyarılabilir dimerizasyon proteinleri ile tasarlanmıştır. İnsan embriyonik böbrek hücre kültüründe yapılan çalışmada; mavi ışık altında gerçekleşen gen düzenlenmesi, ışık kaldırıldığında ise geri dönüşebildiği gözlemlenmiştir. Yapılan bu çalışmayla ışık ile uyarılabilir gen düzenlenmesi ve buna bağlı olarak yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilebileceğini göstermiştir (Nihongaki ve ark., 2015).

Proteinlerin yapı ve fonksiyonunu takip edebilmek amacıyla, proteini kodlayan genle birlikte marker gen (FLAG) vektöre yerleştirilir. Bu vektör daha sonra hücreye aktarılır ve translasyondan sonra proteinin fonksiyonu gözlemlenir. Bu şekilde yapılan çalışmalarda protein ürününü gözlemlemek istediğimiz gen; hücrede gerçekte var olan gen (endogenik) olmayıp, hücreye dışarıdan aktarılan genin protein ürünü takip edilmiş olur. Günümüzde CRISPR Sistem kullanılarak endogenius genin önüne homolog rekombinasyon yardımıyla marker gen yerleştirilerek endogenius genin ürünü olan proteininin; enzimatik analizleri, diğer proteinlerle olan etkileşimleri, posttranslasyonel modifikasyonları ve proteinle ilgili yapısal çalışmalar yapılmıştır (Dalvai ve ark., 2015).

Bu içerik pilinunal tarafından hazırlanmıştır.

Kaynaklar:

• Anders C., Niewoehner O., Duerst A., Jinek M, 2014, Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. September 25; 513(7519): 569–573.
• Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyava, P., Moineau S., Romero D.A., Horvath P., 2007, CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315, 1709–1712.
• Brouns S. J., Jore M. M., Lundgren M., Westra E. R., Slijkhuis R. J., Snijders A. P., Dickman M. J., Makarova K. S., Koonin E. V. & van der Oost J., 2008, Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science 321, 960–964.
• Chavez A., Scheiman J., Vora S., Pruitt BW., Tuttle M., P R Iyer E., Lin S., Kiani S., Guzman CD., Wiegand DJ., Ter-Ovanesyan D., Braff JL., Davidsohn N., Housden BE., Perrimon N., Weiss R., Aach J., Collins JJ., Church GM., 2015, Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat Methods. Apr;12(4):326-8. doi: 10.1038/nmeth.3312.
• Chen B., Gilbert LA., Cimini BA., Schnitzbauer J., Zhang W., Li GW., Park PJ., Blackburn EH.,Weissman JS., Qi LS., Huang B., 2013, Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System. Cell 155, 1479–1491, December 19.
• Cheng AW., Wang H., Yang H., Shi L., Katz Y., Theunissen TW., Rangarajan S., Shivalila CS., Dadon DB., Jaenisch R., 2013, Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. Oct;23(10):1163-71. doi: 10.1038/cr.2013.122.
• Cong L., Zhang F., 2015, Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods Mol Biol. 2015;1239:197-217. doi: 10.1007/978-1-4939-1862-1_10.
• Dalvai M., Loehr J., Jacquet K., Huard CC., Roques C., Herst P., Cote J., Doyon Y., 2015, A Scalable Genome-Editing-Based Approach for Mapping Multiprotein Complexes in Human Cells. Cell Reports 13, 621–633, October 20.
• Deveau H., Barrangou R., Garneau J.E., Labonté J., Fremaux C., Boyaval P., Romero D.A., Horvath P., Moineau S., 2008, Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390–1400.
• Doench JG., Hartenian E., Graham DB., Tothova Z., Hegde M., Smith I., Sullender M., Ebert BL., Xavier RJ., Root DE., 2014, Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9–mediated gene inactivation. Nature Biotechnology 32,1262–1267
• Fu Y., Foden JA., Khayter C., Maeder ML., Reyon D., Joung JK., Sander JD., 2013,  High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. Sep;31(9):822-6. doi: 10.1038/nbt.2623.
• Gilson E., Clément JM., Brutlag D., Hofnung M., 1984,  A family of dispersed repetitive extragenic palindromic DNA sequences in E. coli. EMBO J. Jun;3(6):1417-21.
• Hashimoto KM., Takemoto T.,2015, Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports 5, Article number: 11315.
• Hsu PD., Scott DA., Weinstein JA, Ran FA., Konermann S., Agarwala V., Li Y., Fine EJ., Wu X., Shalem O., TJ., Marraffini LA., Bao G., Zhang F.,2013, DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology 31, 827–832
• Jansen R., Embden JD., Gaastra W., Schouls LM., 2002(a), Identification of a novel family of sequence repeats among prokaryotes. OMICS. 2002;6(1):23-33.
• Jansen R., Embden JD., Gaastra W., Schouls LM., 2002(b), Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol 43: 1565–1575.
• Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna JA., Charpentier E., 2012, A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. Aug 17;337(6096):816-21. doi: 10.1126/science.1225829.
• Kabadi AM., Ousterout DG., Hilton IB., Gersbach CA., 2014,  Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research, Vol. 42, No. 19.
• Konermann S., Brigham MD., Trevino AE., Joung J., Abudayyeh OO., Barcena C., Hsu PD., Habib N., Gootenberg JS., Nishimasu H., Nureki O., Zhang F., 2015, Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. Jan 29;517(7536):583-8. doi: 10.1038/nature14136.
• Maddalo D., Manchado E., Concepcion CP., Bonetti C., Vidigal JA., Han YC., Ogrodowski P., Crippa A., Rekhtman N., de Stanchina E., Lowe SW., Ventura A., 2014, In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. Dec 18;516(7531):423-7. doi: 10.1038/nature13902.
• Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM., 2013, RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. Feb 15;339(6121):823-6.
• Mali P., Aach J., Stranges PB., Esvelt KM., Moosburner M., Kosuri S., Yang L., Church GM., 2013, CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. Sep;31(9):833-8. doi: 10.1038/nbt.2675.
• Mojica FJ., Diez-Villasenor C., García-Martínez J., Almendros C., 2009, Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology. Mar;155(Pt 3):733-40. doi: 10.1099/mic.0.023960-0.
• Mojica FJ., Diez-Villasenor C., Garcia-Martinez J., Soria E., 2005, Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol 60(2):174-182.
• Mojica FJ., Diez-Villasenor C., Soria E., Juez G., 2000,  Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. Mol Microbiol , 36(1):244-246.
• Nihongaki Y., Kawano F., Nakajima T., Sato M., 2015, Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing. Nature Biotechnology 33,755–760.
• Nishimasu H., Ran FA., Hsu PD., Konermann S., Shehata SI., Dohmae N., Ishitani R., Zhang F., Nureki O., 2014, Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. Feb 27;156(5):935-49. doi: 10.1016/j.cell.2014.02.001.
• Qi LS., Larson M., Gilbert LA., Doudna JA., Weissman JS., Arkin AP.,Lim WA., 2013, Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression. Cell 152, 1173–1183, February 28.
• Ran FA., Cong L., Yan WX., Scott DA., Gootenberg JS., Kriz AJ., Zetsche B., Shalem O., Wu X., Makarova KS., Koonin EV., Sharp PA., Zhang F., 2015,  In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. Apr 9;520(7546):186-91. doi: 10.1038/nature14299.
• Ran FA., H PD., Wright J., Agarwala V., Scott DA., Zhang F., 2013, Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. November ; 8(11): 2281–2308.
• Sakuma T., Nishikawa A., Kume S., Chayama K., Yamamoto T., 2014, Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Sci Rep. Jun 23;4:5400. doi: 10.1038/srep05400.
• Shalem O., Sanjana NE., Hartenian E., Shi X., Scott DA., Mikkelsen TS., Heckl D., Ebert BL., Root DE., Doench JG., Zhang F., 2014, Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.Science. Jan 3;343(6166):84-7. doi: 10.1126/science.1247005.
• She Q., Singh RK., et al., 2001,  The complete genome of the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus P2. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 3;98(14):7835-40.
• Shi J., Wang E., Milazzo JP., Wang Z., Kinney JB., Vakoc CR., 2015, Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology 33, 661–667
• Siksnys V., Sapranauskas R., Gasiunas G., 2011, The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic Acids Research, Vol. 39, No. 21 9275–9282 doi:10.1093/nar/gkr606.
• Wang H., Yang H., Shivalila CS., Dawlaty MM., Cheng AW., Zhang F., Jaenisch R., 2013, One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. May 9;153(4):910-8. doi: 10.1016/j.cell.2013.04.025.
• Zalatan JG., Lee ME., Almeida R., Gilbert LA., Whitehead EH., La Russa M., Tsai JC., Weissman JS., Dueber JE., Qi LS., Lim WA., 2015,  Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. Jan 15;160(1-2):339-50. doi: 10.1016/j.cell.2014.11.052.
• Zetsche B., Gootenberg JS., Abudayyeh OO., Slaymaker IM., Makarova KS.,  Essletzbichler P.,Volz SE., Joung J., van der Oost J., Regev A., Koonin EV., Zhang F., 2015, Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. Volume 163, Issue 3, p759–771, 22 October .
• Zuris JA., Thompson DB., Shu Y., Guilinger JP., Bessen JL., Hu JH., Maeder ML., Joung JK., Chen ZY., Liu DR., 2015, Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo Nat Biotechnol. Jan;33(1):73-80. doi: 10.1038/nbt.3081.