T7 endonükleaz I (T7E1), hedeflenen bir mutasyonu ölçmek için sıklıkla kullanılan popüler ve çok faydalı bir enzimdir.

CRISPR, TALEN ve ZFN gibi güçlü genom düzenleme teknolojileri artık birçok farklı organizmada DNA dizilerini değiştirmek için rutin olarak kullanılmaktadır. Bu süreçteki önemli bir adım, nükleotid dizisinin amaçlanan düzenlemesinin veya değişikliğinin onaylanması ve karakterizasyonudur. Çünkü bu genom düzenleme mekanizmalarında amaçlanan mutasyon ve hedef dışı mutasyonlar da gerçekleşebilir. Hatta hiçbir mutasyon gerçekleşmeyebilir. Bu nedenle, amaçlanan mutasyonun meydana gelip gelmediğini doğrulamak zorunludur.

Genom düzenleme sırasında, enzimler, DNA dizisindeki belirli yerlerde çift zincir kırıklarına neden olur ve bu da, nükleotidlerin eklenmesine (insersiyon) veya silinmesine (delesyon) yol açan hataya meyilli homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ile sonuçlanır. NHEJ, CRISPR-Cas9 kullanıldığında oluşan çift zincir kırıklarını hatalı olarak onarabilir (Şekil 1).

Şekil 1. NHEJ, CRISPR-Cas9 kullanıldığında oluşan çift zincir kırıklarını hatalı olarak onarabilir.

Çift sarmallı DNA’daki uyumsuzlukları ve ekstrahelikal loop yapılarını tanıyan bir enzim olan T7 endonükleaz, hatalı zinciri kesmede rutin olarak kullanılır. Bu analizde, potansiyel olarak indel (ekleme-silinme) mutasyonu içeren DNA dizileri ve aynı zamanda indel mutasyonu içermeyen, hedeflenen hücrelerden alınan yabanıl DNA, ilk olarak bölgeye özgü primerler kullanılarak PCR ile çoğaltılır. PCR sırasında, bu sekanslar denatüre olur ve bir hatalı eşleşme içeren heterodubleksler oluşturur. (Yabanıl tip DNA iplikçiği ve indel içeren DNA iplikçiği melezleşerek bir uyumsuzlukla sonuçlanır). Çoğaltılmış DNA daha sonra hatalı eşleşmeleri tanıyan ve hatalı eşleşmelerin upstream kısmından kesen T7 endonükleaz ile inkübe edilirken, yabanıl tip çift sarmallı DNA bozulmadan (kesilmeden) kalır. Yabanıl tip DNA iplikleri ve ortaya çıkan fragmanlar (iki veya daha fazla) daha sonra elektroforez yoluyla bir agaroz jelde yürütülerek DNA bant yoğunluğunun görüntülenmesi ve ölçülmesiyle indel frekansı nicel olarak ölçülebilir hale gelir (Şekil 2).

Şekil 2. T7 Endonükleaz I kullanılarak genom düzenlemenin değerlendirilmesi.

Şekil 3. T7EI testiyle ortaya çıkan hedeflenmiş mutasyonlar. CRISPR-Cas9 ile 3 farklı gRNA ile hedeflenen indeller gerçekleşmiştir. Siyah oklar kesilen farklı bant boyutlarını göstermektedir.

T7EI’in Avantaj ve Dezavantajları

Endonükleaz T7’nin kullanımının birçok avantajı vardır. Nispeten kolay ve ucuz bir yöntemdir. Birçok numune için kullanılabilir ve orta derecede yüksek verimlidir. Bu analizin sonuçları birkaç saat içinde alınır ve PCR ürününün T7 endonükleaz ile inkübasyonundan önce genellikle saflaştırılmasına gerek yoktur. Bununla birlikte, bu analiz yalnızca küçük indelleri tanıyabilir, spesifik mutasyonu belirleyemez. T7 endonükleaz, tek nükleotidlerdeki değişiklikleri gözden kaçırabilir. Tek nükleotid polimorfizmlerini (SNP’ler) tanımaz. Ayrıca duyarlılığı, inkübasyon sıcaklığı ve süresi, tuz konsantrasyonu ve enzim miktarı gibi reaksiyon koşullarından büyük ölçüde etkilenir. Yani, spesifik reaksiyon koşullarına bağlı olarak optimizasyona sıklıkla ihtiyaç duyar. Ayrıca, her iki sarmalın da mutasyonu içerdiği çift sarmallı DNA değişikliklerini kolaylıkla saptamayabilir ve mutasyon sıklığının hatalı tahminine neden olabilir.

Kaynaklar:

• Xie K, Yang Y. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. Mol Plant. 2013;6(6):1975-1983. doi:10.1093/mp/sst119
• T7EI