Tripsinizasyon, tripsin enzimi kullanılarak, yapışan hücreleri (adherent cells) kültüre edildikleri kaptan (flask, petri vs.) ayrıştırma işlemidir. Tripsin, proteinleri parçalayan bir proteolitik enzimdir. Tripsin hücre kültürüne eklendiğinde hücrelerin kültür kabına yapışmasını sağlayan proteinleri parçalar.

Tripsin, pozitif yüklü lizin ve arginin yan zincirlerine dayanan substrat spesifikliğine sahip bir pankreas serin proteazdır. Enzim pankreas tarafından salgılanır ve besin proteinlerinin sindiriminde ve diğer biyolojik işlemlerde yer alır. Tripsin, orta büyüklükte bir küresel proteindir ve inaktif bir proenzim, tripsinojen olarak üretilir.

Tripsin, serin proteaz ailesinin bir üyesidir ve peptid bağlarını hidrolize eder. Peptid bağlarını lizin ve arjininin karboksil ucundan (C-terminal) ayırır (Şekil 1). Prolin varsa peptit bağlarını kesmez. Kesim bölgesinin her iki tarafında asidik bir kalıntı varsa, hidroliz hızının daha yavaş olduğu gösterilmiştir.

Şekil 1. Tripsin enziminin lizin ve arjinin arasındaki bağı koparması

Katalitik bölgesinde Histidin-57, Aspartat-102 ve Serine-195 bulunur (Şekil 2). Kesim sırasında serinin nükleofilikliği artar ve proteolizis sırasında amid karbonuna atak kolaylaşır. Tripsin katalitik bölgesinde bulunan aspartat pozitif yüklü lizin ve arjininin çekilmesi ve stabilize edilmesinden sorumludur. Dolayısıyla enzimin özgüllüğünden sorumludur. Bu da tripsinin proteinleri lizin ve arjinin amino asitlerinin karboksil tarafından baskın olarak ayırdığı anlamına gelir. C terminelde prolin varsa kesmez.

Şekil 2. Tripsin enziminin katalitik bölgesi ve substratla olan ilişkisi

Prolin yan zinciri kendi üzerinde eğilerek C_α‘ye bağlı amino grubunun azotuna kovalent olarak bağlanarak bir halka oluşturur.

Tripsin Mekanizması

1- İlk olarak, serin OH üzerindeki hidrojen uzaklaştırılır, böylece oksijen üzerinde negatif bir yük oluşturulur. Negatif yük, oksijene giden fazladan elektronlarla peptit bağına saldırabilir (Şekil 3).

Şekil 3. Tripsin mekanizması

2- Oksijen üzerindeki elektronlar bir karbon-oksijen çift bağını kolayca yeniden oluşturabilir ancak daha sonra karbonla başka bir bağın başlatılması gerekir. Bu durumda, peptidi oluşturan karbon-nitrojen bağı kopar. Nitrojen, histidin nitrojeninden bir hidrojen alır ve enzimden ilk protein kalıntısı salınır (Şekil 4).

Şekil 4. Tripsin mekanizması

3- Peptit bağı koptu ancak reaksiyon gerçekleşmedi çünkü proteinin diğer yarısı (bazik amino asitli bölüm) hala enzime bağlı. Son iki adım, enzimin proteinin bu ikinci yarısını serbest bırakmasına yardımcı olmak içindir. Bunu başarmak için su eklenir. Sudaki hidrojen, histidine gider ve OH, oksijene negatif bir yük yüklenmesine karşı karboksil karbona bağlanır (Şekil 5)

Şekil 5. Tripsin mekanizması

Tripsin, yapışkan hücreleri kültür kabı yüzeyinden ayırmak ve/veya dokuyu tek hücre süspansiyonu halinde ayrıştırmak için doku kültüründe en yaygın kullanılan enzimdir. Tripsin, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerinde bulunan yapışma proteinlerini keser (Şekil 6).

Şekil 6. Tripsin enzimi yapışan hücreleri (adherent cells) kültüre edildikleri kaptan ve birbirlerinden ayırır.

Hücre kültürü için çoğu tripsin çözeltisi aynı zamanda kalsiyum (Ca⁺²) için bir şelatör görevi gören EDTA içerir. Hücrelerin bulunduğu bir çözeltiden kalsiyum uzaklaştırılarak, hücreleri birbirine tutan kaderinler kırılır ve hücreler, doku kültür kabının yüzeyinden olduğu kadar birbirinden de ayrılır. Yani EDTA, tripsin aktivitesini artırır. Tripsin, serum, divalent Ca⁺² ve Mg⁺² tarafından inhibe edilir.

Kadherinler, kalsiyuma bağlı adezyon molekülleri olarak adlandırılırlar, hücreleri birbirine bağlamak için adherens bağlantılarının oluşumunda önemli olan bir hücre adezyon molekülü (CAM) türüdür. Fonksiyonel olmaları için kalsiyum (Ca2 +) iyonlarına bağımlıdırlar, isimleri de burdan gelmektedir (Şekil 7). Hücre-hücre yapışmasına, hücre dışı kaderin bölgeleri aracılık etmektedir. Oysa hücre içi sitoplazmik kuyrukları, topluca kaderin adezom olarak adlandırılan çok sayıda adaptör ve sinyalleşme proteinleriyle birleşmektedir.

Şşekil 7. Kadherinler hücre-hücre yapışmasında görev alırlar. Kalsiyım bağılıdırlar. Kalsiyum varlığında bağlatılar daha güçlüdür. Ortamdan kalsiyum çekilirse bağlantılar zayıflar, bunun içinde bağlantıları zayıflatmak için tripsin ile EDTA kullanılır. EDTA kalsiyum moleküllerini kendine bağlayarak bağlantıları zayıflatır. Tripsinde proteinleri keserek hücreleri ayırır.

Hücre kültüründe tripsinizasyon yapılacak ise, alt kültüre alınacak hücrelerin eski mediumu uzaklaştırılır, hücreler 1X PBS (w/o Ca⁺², Mg⁺²) ile yıkanır. Daha sonra hücre kültür kabını kaplayacak kadar tripsin (veya tripsin-EDTA) eklenir ve 37 °C de 5 dakika (kullanılan tripsinin markasına göre değişebilir) inkübe edilir. (İnkübasyon boyunca tripsin yukarda anlatılan reaksiyonla proteinleri keser.) Daha sonra tripsinin en az 3 katı kadar medium eklenerek tripsin inhibe edilir (mediumdaki +2 yüklü elementler veya serum sayesinde) ve hücreler santrifüj tüpünde toplanarak santrifüjlenir. Daha sonra hücre yoğunluğuna göre 1:3, 1:5 veya 1:10 alt kültüre alınır.

Kaynaklar:

• Muhlia-Almazán A, Sánchez-Paz A, García-Carreño FL. Invertebrate trypsins: a review. J Comp Physiol B. 2008;178(6):655-672. doi:10.1007/s00360-008-0263-y
• Regnier FE, Kim J. Accelerating trypsin digestion: the immobilized enzyme reactor. Bioanalysis. 2014;6(19):2685-2698. doi:10.4155/bio.14.216
• Kobayashi J, Okano T. Fabrication of a thermoresponsive cell culture dish: a key technology for cell sheet tissue engineering. Sci Technol Adv Mater. 2010;11(1):014111. Published 2010 May 11. doi:10.1088/1468-6996/11/1/014111
• Kadherin