Genom düzenleme çalışmalarında genom üzerinde meydana gelen değişiklikleri belirlemek için bir çok yöntem vardır. Bunlardan bir tanesi de Restriksiyon Enzimi kesim-PCR (RE-PCR) yöntemidir. Bu yöntemle genoma müdahale edilen bölgede insersiyon veya delesyon gibi mutasyonların oluşup oluşmadığına bakılmaktadır.

RE-PCR yöntemi son zamanlarda CRISPR-Cas9 teknolojisiyle yapılan genom düzenleme çalışmalarında sıklıkla kullanılmaktadır. Bir örnek üzerinden bu yöntemin nasıl yapıldığını anlatalım.

CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak hedef gende bir mutasyon meydana getirmek istiyorsunuz. Bu yazımızda hedef genimiz A geni olsun. Bunun için A genine spesifik gRNA tasarlamanız gerekmektedir. Şekil 1’de görüldüğü gibi A hedef genimizin gen bölgeleri bu şekilde olsun ve farklı 2 gRNA tasarlayalım (Şekil 2). Bu gRNA’ların hedef bölgesinde KpnI (gRNA1) ve SacI (gRNA2) restriksiyon enzim kesim bölgeleri var. (gRNA’lar enzim kesim bölgesi içerecek şekilde seçilir.) Aynı zamanda bu gen bölgesine spesifik forward ve reverse PCR primerlerimizi de tasarlayalım (Şekil 1). Bu primerler sayesinde PCR da bu hedef bölgeyi çoğaltabileceğiz.

Şekil 1. Hedef A gen lokusu ve gRNA bağlanma bölgeleri

Şekil 2. gRNA ve hedef DNA bölgeleri

gRNA’larımızı tasarladıktan sonra ilgilenilen hücrelere gRNA ve Cas9 plazmitlerini aktarıyoruz. gRNA1 ve gRNA2 iki farklı deneyle hücrelere aktarılır. 48 saat sonra uygulama yapılan ve kontrol grubu hücrelerinden genomik DNA (gDNA) izolasyonu yapılır. Daha sonra gRNA1 ile muamele edilen gDNA KpnI enzimi ile kesilir. gRNA2 ile muamele edilen gDNA SacI ile kesilir. Enzimlerle kesilen gDNA A gen bölgesine spesifik primerler ile PCR yapılır. Daha sonra örnekler jele yüklenerek bantlar yorumlanır (Şekil 3).

Şekil 3. Mutasyona uğramış genomik bölgeler

Bantları yorumlarken mutasyon olmuş bölgenin PCR’ında bant görülmesi gerekir. Çünkü gRNA hedef bölgeye bağlanır ve Cas9 orada çift zincir kırıkları oluşturur. Hücre bu çift zincir kırıklarını ya homolog rekombinasyon (HR) yöntemini kullanarak ya da homolog olmayan uç birleştirmesi (NHEJ) yöntemini kullanılarak tamir eder. NHEJ yöntemi HR yöntemine göre daha fazla tercih edilmektedir. Fakat bu her zaman böyle değildir, hücre döngüsüne, post-translasyonel modifikasyonlara ve kromatinin etkilerine bağlı olarak değişmektedir. NHEJ ile onarılırsa mutasyona katkıda bulunma potansiyeli yüksektir. Hücre çift zincir kırıklarını NHEJ ile tamir ederken o bölgeye rastgele bazler ekler veya oradan rastgele bazları siler. Bunun sonucunda hedef bölgedeki RE kesim bölgesi mutasyona uğrar ve değişir. Kesim bölgesi değişince RE enzimleri o bölgeyi kesemez ve DNA’nın bütünlüğü korunur. Spesifik primeler bu DNA’ya bağlanarak DNA bölgesini çoğaltır ve bu çoğalmış DNA jelde görünür bantlar verir (Şekil 3; KpnI ile kesilmiş gDNA- gRNA1, SacI ile kesilmiş gDNA- gRNA2).

Mutasyon meydana gelmediyse jelde bant görülmemesi gerekmektedir. Çünkü RE enzim kesim bölgesi değişmeyecektir ve RE enzimleri o bölgeden DNA’yı keserek ayıracaktır. Primerler DNA’ya bağlansa bile uzama işlemi gerçekleşmeyecektir ve jelde bant gözükmeyecektir (Şekil 3; KpnI ile kesilmiş gDNA- Boş kontrol vektörü, SacI ile kesilmiş gDNA- Boş kontrol vektörü). Bantlar yorumlandıktan sonra mutasyonun oluşup oluşmadığına karar verilir. RE-PCR basamakları Şekil 4’te genel hatlarıyla verilmiştir.

Şekil 4. RE-PCR işlemlerinin aşamaları

Bir sonraki aşamada ise mutasyonların ne şekilde (insersiyon veya delesyon) meydana geldiğinin anlaşılması için PCR örnekleri sekanslanarak bu bilgiler öğrenilebilir (Şekil 5).

Şekil 5. Mutasyonların nasıl gerçekleştiği dizi sekansları incelenerek bulunabilir.

Kaynakça:

• Xie K, Yang Y. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. Mol Plant. 2013;6(6):1975-1983. doi:10.1093/mp/sst119
• Her J, Bunting SF. How cells ensure correct repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 2018;293(27):10502-10511. doi:10.1074/jbc.TM118.000371