Bilim insanı @Bilim_insani_835

Pandemide kullanılan yeni koronavirüs testleri!

Araştırmacılar, koronavirüsü teşhis etmek ve haftada milyonlarca kişiye test yapabilmek için yeni yöntemler geliştirmeye çalışıyorlar. Mart ayında, Tayland da koronavirüs salgını artmaya başladığında, Bangkok’taki üç hastane, reaktiflerin tükenmesi nedeniyle koronavirüs testini askıya aldıklarını açıkladı. Taylandlı araştırmacılar, ülkenin klinik laboratuvarlarının talebini karşılamaya yardımcı olmak için çalışmalara başladı. Uygun fiyatlı ve kullanımı kolay testler arayan Rayong Vidyasirimedhi Bilim ve Teknoloji Enstitüsü’ndeki biyolog Chayasith (Tao) Uttamapinant, CRISPR’ın keşfinde rol oynayan Feng Zhang ile gen düzenleme teknolojisinden esinlenerek koronavirüs testi geliştirdiler.


Epidemiyologlar, SARS-CoV-2 için haftada milyonlarca test gerektiren toplu testlerin mevcut krizden çıkmanın en pratik yolu olduğunu söylüyorlar. Yetkililerin testi pozitif olan kişileri izole etmelerine, hastalığın yayılmasını sınırlamasına ve kısıtlamaların güvenli bir şekilde gevşetilmesine yardımcı olacağını düşünüyorlar. Ülkeler de testi hızlandırmak için mücadele ediyorlar. Testi hızlandırmak istemelerinin bir nedeni, SARS-CoV-2’yi saptamak için, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) olarak adlandırılan tekniğin eğitimli personel gerektirmesi, özel kimyasal malzemeler, pahalı aletler, sonuç vermesi saatler süren ve genellikle yalnızca rutin, merkezi hizmetler sunan laboratuvarlarda bulunan pahalı araçlar gerektirmesidir. Bu, özellikle gelişmekte olan ülkelerde yapılabilecek test sayısını sınırlandırmaktadır. Amerika Birleşik Devletleri gibi zengin ülkelerde bile, tedarikçiler tedarik zinciri sorunları nedeniyle ciddi bir test kiti ve gerekli malzeme (burun temizleme bezlerinden kimyasal reaktiflere kadar) sıkıntısı bildirmiştir.

Dünyadaki araştırma grupları PCR’nin ötesine geçen testler geliştirmektedir. Bu testlerin hepsi de viral materyali saptayan ve farklı şekillerde teşhis eden yöntemlerdir: bazıları RT-PCR için testi daha hızlı veya daha kolay hale getirmektedir; diğerleri ise SARS-CoV-2’nin genetik materyallerini teşhis etmek için CRISPR gen düzenleme aracını kullanır; bazıları virüsün yüzeyinde bulunan proteinleri kullanarak virüsü teşhis etmeye yarar.

Yeni testler yakında hazır olursa, mevcut salgın hastalıklar ve gelecekteki salgınlara karşı iyi bir haber olacaktır. İsviçre’deki Cenevre Üniversitesi’nde bir virolog olan Isabella Eckerle, gelişme aşamasındaki testlerin birçoğunun genetik sekansı çözüldükten sonra ortaya çıkan bir patojene kolayca uyarlanabileceğini belirtmiştir.

Koronavirüs testleri iki geniş kategoriye ayrılır:

  1. Bir kişinin aktif bir enfeksiyonu olup olmadığını teşhis etmek için genetik materyali tespit edenler
  2. Enfekte olmuş ve virüse karşı bağışıklık tepkisi geliştirmiştir kişilerin antikorların varlığını tespit edenler


Antikor testlerinin sınırlı tanısal kullanımı vardır: bir kişi enfeksiyon sırasında erken test edilirse, bağışıklık tepkisi hala gelişiyorsa, test antikorları algılamayabilir. Koronavirüsü olan insanlar semptomların başlangıcında en bulaşıcı oldukları için, viral materyal testleri, kimin izole edileceğini belirlemek için çok önemlidir.


RT-PCR kullanan altın standart tanı testi, bir kişinin burnundaki veya boğazındaki hücrelerden veya sıvıdan alınan bir örneği SARS-CoV-2’den belirli bir genetik diziyi bularak belirler. Viral sekans bulunursa, teknik onu tespit edilebilen seviyelere yükseltir.

İlk olarak, virüs RNA’sı DNA’ya dönüştürülür. Daha sonra, virüse spesifik primerler tasarlanarak varsa virüs genomuna bağlanması ve tekrarlanan ısıtma-soğutma işlemleriyle dizinin milyonlarca kez çoğaltılması sağlanır, problar viral genetik kodun belirli bölümlerini etiketler. Bu amplifikasyon, mikrolitre başına sadece bir RNA molekülüne kadar ufak miktarlarda virüsün bile tespit edilmesini kolaylaştırır (Şekil 1). Prob etiketler, bir bilgisayar tarafından ölçülen ve virüsün varlığını işaretleyen bir floresan sinyali salar. Koronavirüs için standart RT-PCR testleri bir ila dört saat sürer ve %100’e kadar doğru olabilir – ancak herhangi bir tanı testinin doğruluğu, enfeksiyon sırasında ne zaman bir örnek alındığı gibi birçok faktöre bağlıdır.


RT-PCR ile koronavirüs testi   <p><strong style="color: rgb(0, 0, 0);">&nbsp;RT-PCR ile koronavirüs

Şekil 1. RT-PCR ile koronavirüs testi yapılmasının basitleştirilmiş şeması


Çeşitli yaklaşımlar, DNA’nın sabit bir sıcaklıkta çoğaltılması, birden fazla ısıtma ve soğutma ihtiyacını ortadan kaldırmayı ve harcanan zamanı azaltmayı amaçlamaktadır. Bunlardan bazıları SARS-CoV-2’yi tespit etmek için özelleştirilen testlerdir. Örneğin, ABD sağlık şirketleri Cepheid ve Abbott, küçük boyutlu donanım platformlarında çalışan ve gerçekleştirilmesi bir saatten az süren koronavirüs analizleri geliştirmiştir. Diğer birkaç test, sabit bir sıcaklıkta çalışan ve Zika gibi virüsleri tanımlamak için kullanılan döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP: loop-mediated isothermal amplification) adı verilen bir tekniğe dayanmaktadır (Şekil 2). LAMP, biri viral RNA’yı DNA’ya çevirmek, diğeri DNA’yı kopyalamak için iki enzime ve ayrıca viral genomun farklı snippet’lerini tanımak için tasarlanmış dört ila altı kısa primer setine dayanır. Bu fragmanlar, RT-PCR’de olduğu gibi sadece kopyalamanın başlatılmasına yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda yeni kopyalanan DNA iplikçiklerinin standart PCR’dan çok daha hızlı amplifiye edilebilen ilmekli yapılar oluşturmasına izin verir. Bununla birlikte, daha az doğrudur ve bir seferde sadece birkaç düzine numune test edilebilir.


LAMP: loop-mediated isothermal amplification  <p><span style="color: rgb(42, 42, 42);">LAMP: loop-me

Şekil 2. Loop the Loop yöntemiyle koronavirüs testinin şeması


SARS-CoV-2 için LAMP tabanlı bir test geliştiren Stockholm’deki Karolinska Enstitüsü’nde genomik uzmanı olan Vicent Pelechano, teknik özel enstrümanlara ihtiyaç duymadığından, açık alanla, uzak bölgeler ve mülteci kampları da dahil olmak üzere gelişmiş ekipmanların bulunmadığı bölgelerde kullanılabileceğini belirtiyor. “İhtiyacınız olan tek şey, primerler, pipet, portatif ısıtıcı ve su içeren bir test tüpü” diyor. Tek bir testin maliyeti yaklaşık 1$’dır.


Laboratuvar ortamında Pelechano ve meslektaşlarının LAMP tabanlı testi, SARS-CoV-2 genomunun en az 10 kopyasını 40 dakikadan daha kısa bir sürede tespit edebildi. Araştırmacılar daha sonra deneyi koronavirüs enfeksiyonu doğrulanmış 248 kişiden alınan numuneleri kullanarak test ettiler ve virüsü yaklaşık %90 oranında tespit edebildiler.


İsveç’teki Umeå Üniversitesi’nde klinik mikrobiyolog olan Nabil Karah, düşük gelirli ülkelerde ve savaşta zarar görmüş bölgelerin koronavirüs için standart tanı testi yapmak için yeterli PCR makinesine sahip olmadığını söylüyor. Karah, yerel test kapasitesini artırmak için LAMP tabanlı testlerini Suriye’ye getirmek için diğer bilim insanları ve Pelechano’nun ekibiyle birlikte çalışıyor.


Koronovirüs testlerini güçlendirmek için en az iki ekip gen düzenleme teknolojisi olan CRISPR’den yararlanmaktadır. Örneğin, Zhang’in yürütücülüğünü yaptığı araştırmacı grubundaki araştırmacılar, yaklaşık bir saat içinde tek bir test tüpünde çalıştırılabilen bir koronavirüs testi geliştirdi. Bu testte yine de numunenin yaklaşık 65°C’ye ısıtılması gerekiyor ve PCR bazlı bir test kadar hassas değildir. Zhang bu konuda “Sorun değil, çünkü kullanımı çok daha kolay” diyor. Koronavirüs ile enfekte olmuş 12 kişiden alınan numuneler üzerinde birçok kez test edildiğinde, test neredeyse her durumda virüsü tespit etmiştir.


Araştırmacılar, SARS-CoV-2 genomunun belirli bir kısmına kenetlenmek için bir kılavuz molekül programlamaktadır. Kılavuz molekül bir eşleşme bulursa, bir CRISPR enzimi, bir floresan ışıltısı veya serolojik çubuğunda koyu bir bant olarak algılanabilen bir sinyal üretir (Şekil 3). 6 Mayıs’ta ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) acil kullanım için SHERLOCK koronavirüs testine izin verdi. Test, Cambridge, Massachusetts’teki biyoteknoloji firması Sherlock BioSciences (Zhang’ın kurucu ortağı) tarafından yapıldı ve şirket kitleri seri olarak üretmek için bir üretici ile ortaklık kurdu.


CRISPR tabanlı koronovirüs test kiti  <p><strong style="color: rgb(0, 0, 0);">CRISPR tabanlı koronov

Şekil 3. CRISPR tabanlı koronovirüs test kiti


Kaliforniya Üniversitesi Berkeley’den CRISPR öncüsü Jennifer Doudna tarafından kurulan Mammoth Biosciences da CRISPR tabanlı koronavirüs testi için acil kullanım izni istemiştir. Test, bu teknolojinin insan papilloma virüsünü tespit edebildiğini gösteren önceki araştımanın sonucuna dayanmaktadır. San Francisco’da bulunan bir şirket şimdi de testi herkesin evde kullanması için yeterince basit ve ucuz yapmaya çalışmaktadır. Avustralya’nın Sydney kentindeki New South Wales Üniversitesi’nde biyomühendis olan Guozhen Liu, CRISPR gibi teknolojilerin mevcut pandemide “bir oyun değiştirici” olabileceğini söyledi.


Koronavirüs tanı testlerinin değerlendirilmesi  <p><strong style="color: rgb(0, 0, 0);">&nbsp;Koron

Tablo 1. Koronavirüs tanı testlerinin değerlendirilmesi


Daha hızlı ve daha ucuz teşhis testleri için farklı bir yaklaşım, virüsün genomunu tespit etmeye çalışmak yerine virüsün yüzeyinde bulunan molekülleri aramak olacaktır. Böyle bir test belirli bir proteine ​​veya antijene bağlanmak üzere uyarlanmış bir antikor içerecektir. Üretilmesi ucuz ve yürütülmesi kolay olan bu tahliller, influenza enfeksiyonlarını tespit etmek için zaten kullanılmaktadır.


8 Mayıs’ta FDA, virüsün yüzeyinde nükleokapsid proteinini hedefleyen bir koronavirüs antijen testi için ilk acil kullanım yetkisini verdi. Tayvan Academia Sinica’dan biyolog An-Suei Yang’ın 20 dakika içinde sonuç verebilecek benzer bir testi geliştirdiklerini söyledi. Yang’ın ekibi, koronavirüs yüzeyindeki proteinlere bağlanabilen antikorları tanımlamak için yapay zeka kullandı. Yang, araştırmacıların henüz enfekte kişilerden alınan koronavirüs örnekleri üzerinde test etmediğini söylüyor.

Bir test laboratuvarda güzel bir şekilde çalışsa bile, kitlesel kullanımında hala zorlu bir yolculukla karşı karşıyadır. İlk zorluk, performansını doğrulamaktır, çünkü kalitesi değişebilmektedir. Cenevre’deki Dünya Sağlık Örgütü ve Üniversite Hastaneleri ile işbirliği yapan kar amacı gütmeyen bir grup olan Yenilikçi Yeni Teşhis Vakfı’nın (FIND) CEO’su Catharina Boehme, FIND’ın değerlendirdiği çoğu RT-PCR tabanlı testin altın standart kadar iyi performans gösterdiğini, antijen testlerinin beklentilerin altında kaldığını söyledi. Başka bir engel, seri üretim için tahlilleri arttırmaktır. Bu kısıtlama göz önüne alındığında, Boehme, tüm yeni testlerin yıl sonundan önce uygulanacağının gerçekçi olmadığını düşünüyor. Ancak bir kez hazır olduklarında, ülkeleri haftada milyonlarca test hedefine yakınlaştırmak için altın standardının yanında çalışabilirler ve dünyayı bir sonraki salgın için hazırlayabilirler.


Kaynaklar:

  • Nature 583, 506-509 (2020) doi: 10.1038/d41586-020-02140-8
  • Yu, L. et al. Preprint at medRxiv https://doi.org/10.1101/2020.02.20.20025874 (2020).
  • Yu, L. et al. Clin. Chem. https://doi.org/10.1093/clinchem/hvaa102 (2020).
  • Schmid-Burgk, J. L. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.04.06.025635 (2020)
  • Joung, J. et al. Preprint at medRxiv https://doi.org/10.1101/2020.05.04.20091231 (2020).
  • Gootenberg, J. S. et al. Science 356, 438–442 (2017), DOI: 10.1126/science.aam9321.
  • Broughton, J.P., Deng, X., Yu, G. et al. CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol 38, 870–874 (2020). https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4
  • Chen, J. S. et al. Science 360, 436–439 (2018), DOI: 10.1126/science.aar6245.
  • Ackerman, C.M., Myhrvold, C., Thakku, S.G. et al. Massively multiplexed nucleic acid detection with Cas13. Nature 582, 277–282 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2279-8


2

Henüz hiç yorum yapılmamış.

Yorum yazmak için giriş yapmanız gerekli