Absorbans ölçümleri, belirli bir dalga boyunda absorbans veren molekülleri ölçeceğinden, nükleik asit numunelerini ölçerken doğru sonuçlar elde etmek için örneklerin saf olması gerekir. Nükleotidler, RNA, ssDNA ve dsDNA’nın hepsi 260nm’de absorbans verecek ve toplam absorbansa katkıda bulunacaktır.

Nükleik asitler 260nm'de proteinler 280nm'de maksimum absorbansa sahiptir. Tarihsel olarak, bu dalga boylarındaki absorbans oranı hem nükleik asit hem de protein ekstraksiyonlarında bir saflık ölçüsü olarak kullanılmıştır. 260nm ve 280nm’deki absorbans oranı, DNA ve RNA’nın saflığını değerlendirmek için kullanılır. DNA için 1.8 oranı genellikle “saf” olarak kabul edilir; 2.0 oranı RNA için “saf” olarak kabul edilir. Oran her iki durumda da kayda değer ölçüde düşükse, 280nm’de veya yakınında güçlü bir şekilde absorbans veren protein, fenol veya diğer kontaminantların varlığını gösterebilir. Benzer şekilde 230nm’deki absorbans da diğer kontaminasyonun sonucu olarak kabul edilir; bu nedenle A260/A230 oranı da sıklıkla hesaplanmaktadır. “Saf” nükleik asit için 260/230 değerleri genellikle ilgili A260/A280 değerlerinden daha yüksektir. Beklenen A260/A230 değerleri 2.0-2.2 aralığındadır.

Nükleik asitlerin ekstraksiyon prosedürlerinden kaynaklanan kimyasal atık kontaminasyonu, nükleik asit konsantrasyonunun fazla tahmin edilmesine neden olabilir. Şekil 1, DNA’nın uygun şekilde temizlenmezse örnek saflığını etkileyecek olan dört yaygın ekstraksiyon reaktifi için bir örnek spektrumunu göstermektedir.

Şekil 1: Nükleik asitlerin izolasyonunda kullanılan reaktiflerin spektrumu.

A) TRIzol B) Fenol C) Guanidin HCL ve D) Guanidinyum izosiyanat

kontaminasyonun belirlenmesi

İzole edilen örneklerin spektrumlarının incelenmesi, örnek saflığı ile ilgili bir problemin tespit edilmesinde yararlı olmaktadır. Her örneğin ölçümünden sonra aşağıdakilerin gözden geçirilmesi önerilmektedir:

• A260/A230 oranı düşükse, 230nm veya daha düşük dalga boyuna sahip kontaminantın absorbansının sonucu olabilir.
• A260/A280 oranı düşükse, 280nm veya daha düşük dalga boyuna sahip kontaminantın absorbansının sonucu olabilir.

A260/A280 Oranı

Anormal A260/A280 oranları genellikle numunenin protein veya fenol gibi bir reaktiflerle kontamine olduğunu veya ölçümle ilgili bir sorun olduğunu göstermektedir.

Düşük bir A260/A280 oranına:

• Ekstraksiyon protokolü ile ilişkili fenol veya diğer reaktiflerin kalıntıları
• Çok düşük konsantrasyonda (>10 ng/µL) nükleik asit izole edilmiş olması neden olabilir. Yüksek A260/A280 saflık oranları bir sorunun göstergesi değildir.

A260/A230 Oranı

Bu oran, nükleik asit saflığının ikincil bir ölçüsü olarak kullanılır. “Saf” nükleik asit için A260/A230 değerleri genellikle ilgili A260/A280 değerlerinden daha yüksektir. Beklenen A260/A230 değerleri genellikle 2.0-2.2 aralığındadır. Oran beklenenden düşükse, 230nm’de emilen kontaminasyon varlığı, örnek veya ekstraksiyon prosedürü ile ilgili bir problemi gösterebilir, bu nedenle her ikisini de dikkate almak önemlidir.

Düşük bir A260/A230 oranı:

• Karbonhidrat kontaminasyonu (genellikle bitkiden izolasyonla ilgili bir sorun)
• Nükleik asit ekstraksiyonundan kalan fenol
• Guanidin kalıntısı (genellikle kolon bazlı kitlerde kullanılır)
• Çökeltme için kullanılan glikojen bu oranın düşük olmasını neden olabilir.

Yüksek bir A260/A230 oranı:

• Kirli bir cihazda boş (blank, kör) ölçüm yapılması
• Boş ölçümü için uygun olmayan bir çözücünün kullanılması. Boş solüsyonu DNA’nın çözdürüldüğü solüsyon ile aynı olmalı ve numune solüsyonu ile benzer iyonik kuvvete ve pH’ya sahip olmalıdır. Örnek olarak TE içinde çözülmüş numuneler için boş ölçümü için su kullanılması düşük A260/A230 oranlarına neden olabilir. TE ile çözülen DNA’nın boş ölçümü TE ile yapılmalıdır.

Şekil 2. Protein veya diğer organik bileşiklerin 260 nm’de ölçüm sonucuna etkisi

Nükleotit Absorbansları

DNA ve RNA içeren beş nükleotit, geniş ölçüde değişen A260/A280 oranları sergilemektedir. Aşağıdaki absorbans değerleri, bağımsız olarak ölçüldüğünde her bir nükleotit için tahmin edilen A260/A280 oranlarını temsil etmektedir:

• Guanine: 1.15
• Adenin: 4.50
• Sitosin: 1.51
• Urasil: 4.00
• Timin: 1.47

İncelenen nükleik asit için sonuçta elde edilen A260/A280 oranı, mevcut dört nükleotit için 260/280 oranlarının ağırlıklı ortalamasına eşit olacaktır. DNA ve RNA için genel olarak kabul edilen 1.8 ve 2.0 oranlarının “temel kurallar” olduğuna dikkat etmek önemlidir. Gerçek oran, nükleik asidin bileşimine bağlı olacaktır.

Not: RNA, Timinine kıyasla daha yüksek Urasil oranına bağlı olarak daha yüksek A260/A280 oranına sahip olacaktır.

Not: EDTA, karbonhidratlar ve fenol 230nm civarında absorbansa sahiptir. TRIzol reaktifi, UV içinde hem 230nm hem de 270nm’de absorbans veren bir fenolik çözeltidir.

Not: DNA izolasyonları için kullanılan Guanidin HCL 230 nm’de absorbans verirken, RNA izolasyonları için kullanılan guanidin izotiyosiyanat 260 nm’de absorbans vermektedir.

Kaynaklar:

• Saflık
• NanoDrop
• Ölçüm