PCR (Polymerase Chain Reaction, Polimeraz Zincir Reaksiyonu), basitçe tek bir test tüpünde DNA’yı bir dizi reaktif ile karıştırıp, tüpü bir sıcaklık düzenleyicisine (PCR cihazı, thermal cycler) yerleştirerek, karışımın önceden programlanmış bir şekilde değişen bir dizi sıcaklıkta inkübe edilmesini sağlayan yöntemdir. İstenilen DNA bölgesi bu yöntemle çoğaltılabilir.

PCR deneyindeki temel adımlar aşağıdaki gibidir (Şekil 1):

1. Hazırlanan karışım 94°C’ye ısıtılır, bu sıcaklıkta çift sarmallı DNA molekülünün iki sarmalını bir arada tutan hidrojen bağları kırılır ve molekülün denatüre olmasına neden olur. Yani çift zincirli DNA birbirinden ayrılır.

2. Karışım 50-60°C’ye soğutulur. İki DNA zinciri bu sıcaklıkta tekrar birleşebilir, ancak karışımımda bulunan ve belirli pozisyonlarda DNA moleküllerine bağlanan primerler (oligonükleotidler) DNA zincirlerine spesifik yerlerden bağlandığı için iki zincir birbirine bağlanmaz.

3. Sıcaklık 74°C’ye çıkarılır. Bu, karışımda bulunan Taq DNA polimeraz enzimi için optimum çalışma sıcaklığıdır.

Bu aşamada anlamamız gereken tek şey, Taq DNA polimerazın her primerin 3′ ucuna bağlanması ve PCR’nin bu adımı sırasında kalıp DNA moleküllerini tamamlayıcı yeni DNA ipliklerini sentezlemesidir. Bu aşamadan sonra bir yerine 2 tane çift zincirli DNA olur.

4. Sıcaklık 94°C’ye yükseltilir. Her biri orijinal molekülün bir şeridi ve bir yeni DNA şeridinden oluşan çift sarmallı DNA molekülleri, tekrardan denatüre olarak tek zincire ayrılır.

Bu, sonunda 4 çift zincirli DNA oluşacağı ikinci bir denatürasyon-bağlanma-uzama döngüsüne neden olur.

Döngü 30 kez tekrarladığında çift sarmallı DNA molekülünden 130 milyondan fazla yeni çift sarmallı DNA molekülü oluşturulur. Her bir kopya primerlerin bağlandığı aralığın bir kopyasıdır.

Şekil 1. Polimeraz zincir reaksiyonundaki temel adımlar

Kaynakça:

• Brown, TA 2010, Gene Cloning and DNA Analysis, An Introduction. 6th edition. 6th edn, John Wiley & Sons Ltd, Chichester.