Agrobacterium tumefaciens, doğal-bitki genetik mühendisi olarak adlandırılan bir toprak bakterisidir (Şekil 1). Bu bakteri evrimsel süreçte, bitki hücrelerine kendi DNA’sını aktarmasını sağlayan kendine özgü bir yetenek geliştirmiştir. Aktarılan bu DNA, T-DNA olarak adlandırılmaktadır ve bu DNA Ti (tümör oluşumunu uyaran - tumour inducing) plazmit olarak adlandırılan bir ekstrakromozomal plazmit üzerinde taşınmaktadır.

Şekil 1. Soya fasulyesi dokusu üzerinde büyüyen Agrobacterium

Yapılan genom mühendisliği çalışmalarıyla Ti plazmit artık enfekte ettiği bitki hücrelerinde tümör oluşumuna neden olmamaktadır fakat T-DNA bölgesini hala aktarma özelliğine sahiptir. Bitki hücrelerine direkt DNA aktarımı kullanan yöntemlerin aksine, iki farklı biyolojik sistemin (bakteri ve hedef bitki hücresi) işin içine girmesinden dolayı Agrobacterium kullanımı karmaşık olarak görünebilir. Bu durum bitki transformasyonunun ilk yıllarında doğruydu ama günümüzde bitki transformasyon çalışmalarının bir çoğunda Agrobacterium kullanılmaktadır. Biyolojik vektör olmadan DNA aktarımını kullanan yöntemlerde (yani direkt DNA aktarımında) DNA’nın hedef hücrenin çekirdeğine ulaştırılması gerekmektedir. Fakat Agrobacterium‘da T-DNA’nın kendisi, oraya ulaştırılması için gerekli sinyalleri zaten barındırmaktadır.

Direkt DNA aktarım sistemlerinin çoğu pahalı cihazlar gerektirmektedir. Agrobacterium ise basitçe uygun besi yerinde büyütülerek hazırlanmakta ve bitki dokusuyla buluşturulmaktadır. Basit bir şekilde yabancı DNA aktarımı ve Agrobacterium ile gen aktarımı yapılan bitkilerde transgen fonksiyonunun daha istikrarlı olduğu gibi varsayımlar geçerli olabilir de olmayabilir de. Bu durumun kullanılan sistemin doğasından kaynaklı bir problemden çok, direkt DNA aktarım sistemlerinde DNA’nın nasıl aktarıldığına bağlı olduğu görülmektedir. Tam anlamıyla transformasyon başarısını göz önüne aldığımızda, 1980’li yılların ortalarından bu yana Agrobacterium aracılığıyla DNA aktarım sürecine ait anlayışımızdaki gelişmeler, verimlilikte ve bu transformasyon vektörlerinin kullanımında büyük bir artışa neden olmuştur.

Agrobacterium’un Tarihi

Agrobacterium tumefaciens doğal olarak ortaya çıkan ve bitkilerde taç uru denilen bir hastalığa neden olan bakteridir. Taç uru hastalığı birçok bahçe bitkisinde özellikle gül, üzüm ve iğ ağacı gibi bitkilerde bir problem olarak kendini göstermektedir. Bu hastalığın başlıca belirtisi gövdenin kesilen yerlerinden veya bitkinin taç kısmında oluşan tümör veya urdur (Şekil 2).

Şekil 2. Taç tümörü

Taç, bitkinin toprak ile havanın kesişim yerinde uzanan bölümüdür. Hastalıklı bir organizmadan alınan özütün sağlam bir bitkiye bulaştırıldığında mutlaka hastalığa neden olacağı varsayımına dayanan Koch esaslarına uymadığı için, bu hastalık yıllarca bitki patologları için bir gizem olarak kalmıştır. Hastalığın gizeminin ortadan kaldırılması kendi başına çok etkileyici bir hikayedir ve bakterilerin genom mühendisliği araştırmalarında kullanımına yol açmıştır. Taç uru hastalığında, yabani çeşit Agrobacterium çift çenekli bitkilerin yaralanmış dokularını işgal etmektedir. Burada gövde sıklıkla bölünmüş veya yırtılmış olduğu için taç uygun bir giriş noktasıdır. Bakteriler ya ölü veya ölmek üzere olan hücrelerde koloni oluştururlar ya da kendilerini basitçe yaralamış yaşayan hücrelere yapıştırırlar (Şekil 1).

Şekil 3. Yıldız çiçeği kök sisteminde vejetatif yumruların (beyaz oklar) yanında büyüyen Agrobacterium kaynaklı taç tümörleri (siyah oklar).

Bitki hücresinden bakteri hücresine gönderilen bir seri kimyasal sinyal (asetosiringon) vasıtasıyla bakterideki virülens (vir) genleri aktif hale getirilir ve bakterinin virülens moda geçişi sağlanmış olur. En sonunda T-DNA bakteriden kesilerek bitki hücresine aktarılır. Yabani tip bakterilerde T‐DNA, bitki hormonlarının üretimine yol açan enzimleri ve bakteriler için uygun bir besin kaynağı olan ve azot bakımından zengin bir organik bileşik olan opinleri kodlayan birkaç gen içerir (Şekil 4).

Şekil 4. Ti plazmidinin (doğada bulunan) yapısı

Tümörler bitki hücrelerindeki hormon üretimininin sonucunda oluşurlar. Tümör içindeki üretilen opinler tümör üzerindeki bakteriler tarafından veya yağmurla birlikte tümörden yıkanarak toprağa karışan bakteriler tarafından kullanılır. Bakteriler yaşayan ve bölünen tümör hücrelerinde koloni oluşturmazlar ve bu tümör hücreleri doku kültüründe hormonlar eklenmeden büyütülebilir. Bozulmuş hormon sentez genlerini içeren bazı Agrobacterium mutantlarının oluşturulması ve analizi, hikayenin bölümlerinin aydınlatılmasına yardımcı olmuştur. Eğer hormonları sentezleyen genlerden bazıları bozulursa ve tütün bitkisine bulaştırılırsa, tümör çok sayıda şekilsiz kök oluşturur. Eğer diğer hormonları sentezleyen genler bozulursa , tütüne bulaştırılması sonucunda filizlenen tümör oluşacaktır. Eğer her iki gen de bozulursa tümör oluşmayacaktır (Şekil 5).

Şekil 5. Agrobacteriumlu (solda) ve Agrobacteriumsuz (sağda) hormon biyosentez genleri ile aşılanmış ayçiçeği fide hipokotilleri.

Bu hormon etkisi şüpheli bir biçimde, doku kültüründeki tütün kallusundan elde edilen sonuçlarla aynıydı ve bu farklı tümör fenotiplerin dokudaki değişen hormon dengesinden kaynaklandığı doğru bir şekilde belirlendi.

Gen aktarımı için T-DNA aktarım işleminin kullanılması

Agrobacterium T-DNA aktarım mekanizmasında çok sayıda detaylı araştırma vardır. Biz burada gen aktarımına ilişkin temel özellikleri anlatacağız. Agrobacterium aracılı gen aktarımı için vektör olarak kullanılan plazmit sadece gerekli parçaları içermesi için yavaş yavaş kısaltılmıştır. Agrobacterium vektörleri ikili vektörler olarak adlandırılır: çünkü bütün işlemde yer alan plazmitin ikincisidirler (Şekil 8). Aktarım fonksiyonlarının birçoğu T-DNA uzaklaştırılmış bir Ti plazmiti üzerinde muhafaza edilir. İkinci ikili vektör T-DNA içerir, fakat hormon ve opin sentezleyen genler çıkarılmıştır (Şekil 7).

Şekil 6. Modifiye edilmiş yapay Ti plazmiti

Şekil 7. Yardımcı Ti plazmid

Şekil 8. Transformasyona hazır Agrobacterium. Yapay Ti plazmidi E. coli içinde üretilir ve daha sonra bir yardımcı vektör içeren A. tumefaciens‘e aktarılır. Bu ikinci plazmid(yardımcı vektör), bakteriden bitki hücrelerine DNA transferini kolaylaştıran proteinleri kodlayan vir bölgesini içerir.

Plazmitin bakteride tutulmasını sağlayan bileşikler yanında ikili vektörde kalanlar T-DNA bölgesinin sol ve sağ sınırıdır. İlgenilen genler T-DNA işleme mekanizması için tanıma dizileri olan sınırlar arasına kopyalanır (Şekil 6). T-DNA işleme mekanizması için genler hala ikili plazmitteki T-DNA işleyişini yöneten yer olan değiştirilmiş Ti plazmidinde konumlandırılır (Şekil 7). Agrobacterium uygun bitki dokusuna bulaştırıldıktan sonra bakteri uygun bir konakçı olarak bu hedefi tanıyabilir. Kimyasallar ve sinyaller hem bitki dokusu hem de bakteriler tarafından yayılır. Uygun bitki dokularından yaralanmış bitki dokuları T-DNA aktarım mekanizmasını başlatan bakteriyel virülens (vir) genlerini aktif eden asetoşiringon üretirler. Yaralanmış bitki dokularının hepsi asetoşiringon üretmezler ve başlangıçta tek çeneklilerde asetoşiringon yokluğu veya yetersiz üretimi, Agrobacterium aracılığıyla transgenik monokotiledon eldesini olanaksız kılmakaydı. Bulaştırılmış bitki dokularına yapay aşetoşiringonun eklenmesi tek çeneklerde Agrobacterium aracılığıyla gen aktarımını olağanüstü düzeyde hızlandırır. Bakteriler bitki dokusuna bulaştığında, çoğu bitki saldırıyı defetmeye çalışarak veya antipatojenik bileşikler üreterek veya saldırının yayılmasını engellemek için bulaşmış bölgeye komşu hücreleri feda ederek cevap verirler.

Vir genleri aktif hale geldiğinde, ikili vektördeki T-DNA hedef bitki hücresine taşınması için işlenir. Vir gen ürünlerinin bazıları ikili plazmitten T-DNA’yı tek zincirli DNA molekülü olarak kesip çıkarırlarken, diğer vir gen ürünleri de T-DNA’yı parçalanmaktan korumak için kaplarlar. Hatta DNA’yı bakteriden bitki sitoplazmasına oradan da çekirdeğe yönlendiren sinyaller veya işaretçiler gibi davranarak ek vir genleri T-DNA’ya bağlanır. Bakteri T-zincirinin (tek zincirli, kaplanmış, işaret taşıyan T-DNA’dır) bakteriden hedef bitki hücresine aktarımı için bir kanal olan pilusu diğer bazı vir genlerinin etkisi aracılığıyla üretir. Pilus esas olarak bakteriden hedef hücrenin hücre duvarı boyunca ve sitoplazması içine uzanan bir protein tüptür. T zincir çekirdeğe iletildikten sonra T-zincirdeki sinyal proteinin son görevi T-DNA için bir birleşme noktası bulmak ve konukçu DNA’yı yerleştirmektir. T-DNA temel olarak DNA’nın çok sayıda gen olan ve transkripsiyonel olarak aktif, daha korunmasız ve erişilebilir bölgeler içine yerleşir (Şekil 9).

Şekil 9. Agrobacterium aracılı transformasyon sürecinin basitleştirilmiş bir modeli. Bu modelde doğada Agrobacterium’un kullandığı Ti plazmit yer almaktadır. Transgenik bitki üretmek için modifiye edilmiş yapay Ti plazmti ve yardımcı Ti plazmiti olmak üzere 2 plazmit kullanılır. Yapay Ti plazmtinde aktarılcak gen bulunur, yardımcı Ti plazmitinde vir genlerini kodlayan bölgeler bulunur. Süreç aynı basamakları takip eder.

Bu adımları basamaklar şeklinde yazacak olursak süreç daha net anlaşılacaktır (Şekil 9):

Yaralı bitki dokularından salınan sinyal molekülleri (asetoşiringon) (1), VirA/VirG2 (bakteri reseptörleri) bileşenli sinyal iletim sistemi tarafından tanınır (2).

Sinyal sonrasında bitki hücresine başarılı bir şekilde bağlanır (3) bunu takiben vir genlerinin aktivasyonu, T-DNA sınır dizilerini (left-right border) hedefleyen VirD1/VirD2 endonükleazları oluşturulur. Bu endonükleazlar T-DNA dizisini Ti plazmitten kesip çıkartırlar ve tek iplikçikli bir T-DNA (ssT-iplikçik) oluşturular (4). Kesip çıkarılan dizinin yeri bakteriyel polimerazlar tarafından tamamlanır.

Ardından, VirD2 proteini kovalent olarak T-ipliğinin 5′ ucuna polar bir şekilde bağlanır (“olgunlaşmamış T kompleksi” olarak adlandırılır) (5). VirE2'de T-DNA'ya bağlanarak diziyi endonükleaz aktivitesinden korur.

VirD2/T-ipliği konjugatı daha sonra 11 VirB proteini ve VirD4 tarafından oluşturulan bir salgılama sistemi (T4SS) yoluyla bitki sitoplazmasına aktarılır (6). Bağımsız olarak ve aynı yol kullanılarak, bitkideki transformasyon işlemine hizmet eden diğer bakteriyel virülans proteinleri (VirE2, VirE3, VirF ve VirD5) konakçı hücreye aktarılır.

Güçlü genetik ve in vitro kanıtlar olduğu halde bitkilerde varlığı henüz gösterilmemesine rağmen, “olgun T-kompleksinin”, VirD2 ile konjuge T ipliğini (“olgunlaşmamış T-kompleksi”) VirE2 ile birleştirerek konakçı hücre içinde toplandığına inanılmaktadır (7).

VirD2 ve VirE2’nin ssT-ipliğini 5′ ucuna bağlanarak bitki sitoplazması içindeki ekzonükleolitik saldırıya karşı koruduğu ileri sürülmüştür.

Hem VirD2 hem de VirE2 proteinleri nükleer lokalizasyon sinyalleri (NLS) içerir ve “olgun T kompleksini” bitki çekirdeğine yönlendirmek için pilot proteinler olarak işlev görür. Nükleer membranın geçilmesi ve çekirdek içindeki entegrasyon bölgesinin hedeflenmesi, bakteri ve bitki faktörlerinin birlikte hareket etmesini gerektirir. Katılan bitki bileşenleri hakkında çok fazla şey bilinmemekle birlikte, bu aşamada VirD2 ve VirE2’nin yanı sıra VirF’nin de rol oynadığına dair göstergeler vardır.

Çekirdeğin içinde, eşlik eden proteinler hedeflenmiş proteoliz yoluyla serbest bırakılır ve kaplanmamış tek iplikli T-DNA, çift iplikli bir moleküle dönüştürülür. Daha sonra konakçı kromatindeki yerini bulur ve konakçı genomuna homolog olmayan uç birleştirilmesi ile entegre olur. Başarılı entegrasyonu takiben, T-DNA ile kodlanmış genlerin ekspresyonu bakteriyel proteinlerin sentezine yol açar.

Gen aktarımından sonra yapılacak aşamalar: transgenik hücrelerin belirlenmesi ve bu hücreden transgenik bitkinin yetiştirilmesidir (Şekil 10).

Şekil 10. Agrobacterium ile gen aktarımı sonrası yapılan aşamalar

Kısa notlar:

• Bitki hücresine aktarılan T-DNA da opine ve octopine genlerinin promotörü bitki spesifiktir. Bundan dolayı bitki genomuna girince opine ve octopine şekerlerinin üretimi gerçekleştirilir. Fakat bitki bu şekerleri metabolize edecek enzimlere sahip olmadığından bu şekerleri bakteri kendisi alarak metabolize eder ve enerji sağlar. Bakteri bitkiyi kendisi için çalıştırarak kullanmaktadır.

• T-DNA tek zincir halinde gönderildiği için bakteri daima bu T-DNA dizisini genomunda taşır. Çıkarılan tek zincirli T-DNA dizisi komplementer diziye göre bakteriyal DNA polimerazlar tarafından tamamlanır.
• Yapılan genom mühendisliği ile bu sistem modifiye edilerek bilimsel çalışmalar için bitkiye gen aktarmak için kullanılmaktadır. T-DNA kısmına bitkiye aktarılmak istenen genler aktarılır.

Kaynaklar:

• C. Neal Stewart Jr. (Editor), Plant Biotechnology and Genetics: Principles, Techniques, and Applications, 2nd Edition, ISBN: 978-1-118-82012-4, March 2016
• Daniel I. Păcurar, Hans Thordal-Christensen, Monica L. Păcurar, Doru Pamfil, Constantin Botez, Catherine Bellini. Agrobacterium tumefaciens: From crown gall tumors to genetic transformation. Physiological and Molecular Plant Pathology, Vol: 76-2, 2011, p: 76-81
• Ti plazmit
• Bitki
• Transgenik bitki