vektör 

" />
Bilim insanı @Bilim_insani_835

Restriksiyon enzimleri DNA’yı spesifik bölgelerden keser!

Hücrelerde gen ayrı bir varlık olarak değil, uzun bir DNA molekülünün küçük bir bölgesi olarak bulunur. Bir hücredeki DNA molekülleri mekanik kuvvetle rastgele küçük parçalara bölünebilse de, memeli genomundaki bir gen, ayırt edilemeyen yüz bin veya daha fazla DNA parçası arasında sadece bir tane olacaktır.


Böyle bir gen diğerlerinden nasıl ayrılabilir?


Tüm DNA molekülleri, aynı dört nükleotitin (A, T, G, C) yaklaşık olarak eşit bir karışımından oluşur. Bakterilerden saflaştırılan restriksiyon enzimleri, DNA çift sarmalını spesifik bölgelerden keserek, çift sarmallı bir DNA molekülünü farklı boyutlardaki fragmanlara ayırır. Rekombinant DNA teknolojisinin birçok aracı gibi, restriksiyon nükleazları da ilginç bir biyolojik fenomeni anlamaya çalışan araştırmacılar tarafından keşfedilmiştir. Bazı bakterilerin, deneysel olarak dışarıdan aktarılan “yabancı” DNA’yı her zaman parçaladıkları görülmüştür.


Sorumlu mekanizmanın araştırılması, DNA’yı spesifik nükleotit sekanslarından kesen beklenmedik bir bakteriyel nükleaz sınıfını ortaya çıkarmıştır. Bakteri bu enzimlerden kendi DNA’sını, bu enzimlerin kesim sekansıyla aynı olan sekanslarının metilasyonu yoluyla korur, böylece bir bakterinin kendi genomunun yabancı DNA tarafından istila edilmesini önler. Bu enzimler yabancı DNA’nın bakterilere transferini kısıtladığı için bunlara restriksiyon nükleazları (kısıtlama nükleazları) denir. Bu biyolojik bulmacanın çözülmesiyle, hücre ve moleküler biyologların canlıları çalışma şeklini sonsuza dek değiştiren teknolojilerin gelişmesi sağlandı.


Farklı bakteri türleri, her biri farklı olan ve spesifik bir nükleotit sekansını kesen farklı restriksiyon nükleazları üretir. Bu hedef sekanslar kısa olduğu için (genellikle dört ila sekiz nükleotit çifti), herhangi bir uzun DNA molekülünde, tamamen tesadüfen birçok kesim bölgesi meydana gelir. Restriksiyon nükleazlarının laboratuvarda bu kadar yararlı olmasının nedeni, her bir enzimin her zaman aynı bölgelerde belirli bir DNA molekülünü kesmesidir. Dolayısıyla, belirli bir DNA örneği için (birçok özdeş molekül içerir), belirli bir restriksiyon nükleazı güvenilir bir şekilde aynı DNA fragmanını keserek aynı boyutlarda kesim ürünü üretecektir. Elde edilen fragmanların boyutu, restriksiyon nükleazlarının hedef sekanslarının uzunluğuna bağlıdır.


Şekil 1’de gösterildiği gibi, HaeIII enzimi dört nükleotit çiftinin bir dizisinde keser; bu kadar uzun bir dizinin, yaklaşık olarak her 256 nükleotit çiftinde tamamen tesadüfen meydana gelmesi beklenir.


Restriksiyon enzimleri <h1>Restriksiyon enzimleri&nbsp;</h1><p><br></p>

Şekil 1. Restriksiyon nükleazları DNA’yı belirli nükleotit sekanslarından keser. Diziye özgü DNA bağlayıcı proteinler gibi, restriksiyon enzimleri genellikle dimerler olarak çalışır, tanıdıkları ve parçaladıkları DNA dizisi genellikle merkezi bir nokta etrafında simetriktir. Burada, DNA çift sarmalının her iki ipliği de hedef sekans içindeki belirli noktalarda (kırmızı) kesilir. HaeIII gibi bazı enzimler doğrudan çift sarmalı keser ve kör (küt) uçlu DNA molekülü oluşturur; EcoRI ve HindIII gibi enzimler, her bir zinciri asimetrik keserler ve yapışkan uçlar oluştururlar. Yapışkan uçlar kesilen DNA moleküllerinin tamamlayıcı baz çiftleşmesi ile tekrar birleşmelerine yardımcı olurlar. DNA moleküllerinin bu şekilde birleşmesi DNA klonlaması için önemlidir. Restriksiyon nükleazları genellikle bakterilerden elde edilir ve isimleri kökenlerini yansıtır: örneğin, EcoRI enzimi Escherichia coli‘den gelir. Şu anda yüzlerce farklı restriksiyon enzimi mevcuttur; bunları ticari olarak üreten şirketlerden sipariş edilebilirler.


Buna karşılık, sekiz nükleotit uzunluğunda bir hedef sekansa sahip bir restriksiyon nükleazının, her 65.536 nükleotid çiftinde DNA’yı parçalaması beklenir. Sekans seçiciliğindeki bu fark, uzun bir DNA molekülünün, belirli bir uygulama için en uygun olan fragman boyutlarına bölünmesini mümkün kılar.


Restriksiyon enzimlerinin bu özelliği özellikle klonlama çalışmalarında çok fazla kullanılmaktadır. Gen aktarımı için kullanılan vektörlere gen aktarımı için bu enzimlerle spesifik bölgelerden vektör kesilerek istenilen bölgeye istenilen gen eklenebilir (Şekil 2).


vektör <p><strong style="color: rgb(0, 0, 0);">vektör&nbsp;</strong></p>

Şekil 2. Gen ve vektör aynı enzimlerle kesilerek yapışkan uçlar oluşturularak birleştirilebilir.


Gen klonlama teknolojisinin gelişmesiyle yeni tasarlanan plazmitlere birçok restriksiyon enzim kesim bölgesi eklenmektedir. Bu da araştırmacıya klonlamada kolaylık sağlamaktadır (Şekil 3).

PLAZMİT <p>PLAZMİT</p>

Şekil 3. Bir plazmit örneği


Merak ettiklerinizi yorumlara yazabilirsiniz!


Kaynakça:

  • C. Neal Stewart Jr. (Editor), Plant Biotechnology and Genetics: Principles, Techniques, and Applications, 2nd Edition, March 2016, ISBN: 978-1-118-82012-4
  • Klonlama
  • Plazmit