Düzenli Aralıklarla Bölünmüş Palindromik Tekrar Kümeleri (CRISPR) – CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) sistemi, doğada, faj enfeksiyonuna ve plazmid istilasına karşı bakteriyel savunma mekanizmasıdır. RNA güdümlü DNA hedefleme platformu olarak genom düzenleme, transkripsiyonel düzenleme, epigenetik modülasyon ve genom görüntüleme için yeniden düzenlenmiştir. 

   Bu teknoloji, kısa bir kılavuz RNA yardımı ile hedeflenen hemen hemen her genomik bölgeyi hassas bir şekilde manipüle etmeyi sağlar. Hastalık gelişimi ve ilerlemelerinde yer alan gen fonksiyonunun aydınlatılmasında, hastalığa neden olan mutasyonların düzeltilmesinde kullanılabilir. 

   Nükleaz eksikliği olan Cas9 (dCas9) ile efektör domainin kullanılarak aktifleştirilmiş onkogenlerin etkisizleştirilebilir veya deaktive edilmiş kanser baskılayıcı genlerin aktivasyonu sağlanabilir. Dahası bu programlanabilir endonükleaz teknolojisi tek bir deneyde birden fazla genomik lokusu aynı anda hedefleyerek, birden fazla genin işlevinin tek seferde incelemesini sağlar. 

   Tek kılavuzlu RNA (sgRNA) kütüphaneleri kullanılarak, CRISPR tabanlı genom çapında taramalar, yeni tümör baskılayıcılar veya onkogenler gibi ilaç hedefini veya hastalığa dirençli genleri tanımlamak ve ilaç hedeflerini hızlı bir şekilde değerlendirmek için kullanılabilir. Bu nedenle CRISPR-Cas9 aracılı genom mühendisliği birçok kanser ve nörodejenerasyon formunun yanı sıra orak hücre anemisi, kistik fibroz, Duchenne kas distrofisi, viral enfeksiyonlar, immünolojik bozukluklar ve kardiyovasküler hastalıklar dahil genetik bozuklukları tedavi etmek ve hatta iyileştirmek için büyük bir potansiyele sahiptir.

   CRISPR-Cas9 sisteminin avantajlarına ve büyük potansiyeline rağmen terapötik uygulamalar için bazı engeller vardır. İstenmeyen hedef dışı etki ve mutasyonların azaltılması/önlenmesi, klinik uygulamalarda CRISPR aracılı genom mühendisliğinin etkili kullanımı için çok önemlidir. Bu nedenle, Cas9’un milyarlarca baz çifti uzunluğunda olan genomlar içindeki spesifik 20 baz çifti (bp) hedef sekanslarını nasıl bulduğu ve daha sonra sekansa spesifik çift sarmallı DNA (dsDNA) kesimini nasıl indüklediği CRISPR biyolojisinde kritik bir sorudur. 

   DNA hedefleme belirlenmesi için Cas9 üzerinde yapılan kapsamlı biyokimyasal ve yapısal çalışmalar ile çeşitli protospacer bitişik motif (PAM) varyantları ve Cas9 ortologları CRISPR-Cas9 mekanizmalarını anlamamıza büyük katkıda bulunmuştur.

Şekil 1. Tip II CRISPR-Cas sisteminin savunma mekanizması aşamaları

CRISPR/Cas9 Biyolojisi

Birçok bakteri ve çoğu arkea, bakteriyofaj enfeksiyonu ve plazmid transferine karşı CRISPR lokusları ve beraberindeki CRISPR ile ilişkili (cas) genler tarafından kodlanan karmaşık RNA kılavuzlu adaptif bağışıklık sistemleri geliştirmiştir. Faj veya plazmidlerden gelen istilacı genetik elementlere maruz kalmanın ardından bağışıklık kazandırma işlemi sırasında, konakçı kromozomu içindeki CRISPR tekrar-aralayıcı (spacer) dizisine yeni aralayıcılar olarak kısa yabancı DNA fragmanları entegre edilir. Böylece konakçı aynı işgalci ile gelecekte karşılaşırsa işgalci istilasını önlemek için genomuna eklediği bu diziler sayesinde savunmaya geçer (Şekil 1).

İşgalci organizma geldiğinde CRISPR dizisinin transkripsiyonu ve öncü-CRISPR transkriptlerinin endonükleolitik kesim yoluyla enzimatik olarak işlenmesi kısa olgun CRISPR RNA’ları (crRNA) oluşturur. crRNA’nın 5′ ucunda yabancı genetik elemandan sekansa komplementer kısa bir RNA segmenti olan aralayıcıyı içerir. cRNA 3′ ucu, CRISPR tekrar sekansının bir parçasını içerir. crRNA spacerı ve yabancı hedef sekansa komplementer dizi (protospacer) arasındaki hibridizasyon, ikinci bir enfeksiyon sırasında Cas nükleazları tarafından istilacı DNA veya RNA’nın sekansa spesifik olarak yıkımını tetikler. Yani crRNA+protospacer+Cas nükleazları hedef DNA veya RNA’yı parçalayarak bütünlüğünü bozar ve etkisizleştirir (Şekil 1).

CRISPR-Cas sistemlerinin tanımlayıcı özelliği, DNA hedeflerini tanımak ve eşleşen yabancı sekansları yok etmek için Cas proteinleri ile olgun crRNA’ların crRNA-efektör kompleksleri şeklinde birleştirilmesidir. İstilacı DNA üzerinde crRNA hedefli diziye yakın konumda bulunan kısa bir korunmuş dizi motifi (PAM, 2-5 bp) çoğu CRISPR-Cas sisteminde hedef DNA seçiminde ve yıkımında önemli bir rol oynar.

CRISPR sistemleri, CRISPR-cas lokusunun mevcut sınıflandırmasına göre altı farklı tipte (I-VI) gruplandırılmıştır ve her biri, CRISPR müdahalesi için crRNA ile spesifik bir Cas protein seti kullanmaktadır. Tip I ve tip III sistemleri crRNA bağlanması ve hedef sekansın yıkılması için büyük bir multi-Cas protein kompleksi kullanmaktadır. Bunların aksine, tip II CRISPR sistemi, dsDNA hedeflerini tanımak ve her bir ipliği ayrı bir şekilde kesmek için tek bir DNA endonükleaz kullanır. Bu Cas9 endonükleazıdır. Cas9 iki farklı nükleaz alanı (HNH veya RuvC) içermektedir (Şekil 2).

Şekil 2. Cas9 enziminin yapısı, RuvC ve HNH domainleri

Bu susturma işlemi sırasında, trans-aktive edici crRNA (tracrRNA) adı verilen ilave bir küçük kodlayıcı olmayan RNA, crRNA’daki tekrar dizisiyle hibrid bir RNA yapısı oluşturmak için eşleşir. Bu çift RNA yapısı (tracrRNA+crRNA) kılavuzluk yaparak, Cas9’u 20-nükleotid (nt) uzunluğunda tamamlayıcı bir hedef sekansa ve hedef sekansa bitişik PAM dizini içeren hedef DNA’yı parçalamaya yönlendirir. Tip II sistemlerde crRNA olgunlaşması için tracrRNA gereklidir. Yapılan genetik mühendisliği çalışmalarıyla crRNA ve tracrRNA tek bir RNA transkriptinde birleştirilerek kimerik bir sgRNA oluşturulmuştur. Böylece sistem basitleştirilmiştir ve Cas9 aracılı sekansa spesifik DNA kesim özelliği de korunmuştur.

sgRNA dizisi değiştirilerek CRISPR-Cas9 sistemi ile genomda ilgilenilen herhangi bir DNA sekansı hedeflenebilir ve bölgeye özgü küt uçlu, çift iplik kopması (DSB) oluşturmak üzere programlanabilir. Cas9 tarafından oluşturulan DSB daha sonra hataya yatkın homolog olmayan birleştirme ile onarılır, bu da kesim bölgesinde küçük rastgele eklemeler ve/veya silinmeler ile sonuçlanır, böylece homolog olmayan uç birleştirme tamir yöntemi kullanılarak DSB bölgesinde genom modifikasyonuna yol açar (Şekil 3).

Şekil 3. CRISPR-Cas9 sisteminin mekanizması ve kullanım alanları

CRISPR/Cas9 sisteminin genom mühendisliğindeki potansiyelinin görülmesinden bu yana, tasarım kolaylığı, kullanım kolaylığı ve yüksek verimlilik nedeniyle geniş bir organizma yelpazesinde genom manipülasyonu yapmak için güçlü bir araç olarak hızla bir şekilde kullanılmaya başlanmıştır.

Çinko parmak nükleazları (ZFN’ler) ve transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazlar (TALEN’ler) gibi geleneksel nükleaz aracılı DNA düzenleme tekniklerinin aksine CRISPR/Cas9 sisteminde DNA tanıma proteinleri değil, 20 nt uzunluğundaki kılavuz RNA sekansı hedefleme yapılmaktadır. Böylece hedeflenecek her DNA hedef bölgesi için DNA tanıma domainlerinin oluşturulmasında protein mühendisliği ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu nedenle CRISPR sisteminin bilimsel çalışmalarda, büyük ölçekli genomik manipülasyonlarda ve tarama yapmada yaygın olarak benimsenmesini ve uygulanmasını sağlar.

Cas9 Enzimi

S. pyogenes Cas9 (SpyCas9), büyük (1,368 amino asit) multidomainli ve çok işlevli bir DNA endonükleazdır (Şekil 4). İki farklı nükleaz domaini aracılığıyla PAM’ın 3 bp upstream kısmından keser. Bu iki farklı domain kılavuz RNA sekansına (hedef iplik) tamamlayıcı olan DNA zincirini kesen HNH benzeri bir nükleaz domaini ve DNA’nın kesilmesinden sorumlu bir RuvC benzeri nükleaz domaini tamamlayıcı ipliğin karşısındaki iplikçii kesen (hedef olmayan iplikçik) domaindir (Şekil 1). Cas9, CRISPR girişimindeki kritik rolüne ek olarak, crRNA olgunlaşmasına ve spacer edinimine de katılır.

Şekil 4. Farklı Cas9 enzim yapıları

Apo durumundaki Cas9 yapıları iki ayrı lob içerir: alfa sarmal tanıma (REC) lobu ve nükleaz (NUC) lobu. NUC lobu korunmuş HNH ve bölünmüş RuvC nükleaz domainlerini ve daha değişken C-terminal domainini (CTD) içermektedir (Şekil 5).

Şekil 5. Cas9 yapısındaki iki ayrı lob yapısı

İki lob ayrıca, biri arginin açısından zengin köprü sarmalıyla ve diğeri düzensiz bir bağlayıcıyla (kalıntılar 712-717) oluşturulan iki bağlantı ile bağlanır. REC lobu, üç alfa-sarmal bölgeden (Hel-I, Hel II ve Hel-III) oluşur ve diğer bilinen proteinlerle yapısal benzerliği bulunmaz. Uzatılmış CTD ayrıca Cas9’a özgü bir katlanma gösterir ve PAM sorgulaması için gerekli PAM etkileşimli bölgeleri içerir. Bununla birlikte, bu PAM-tanıma bölgesi, apo-Cas9 yapısında büyük ölçüde bozuktur, bu da apo-Cas9 enziminin aktif olmayan bir konfigürasyonda tutulduğunu ve bir kılavuz RNA’ya bağlanmadan önce hedef DNA’yı tanıyamadığını gösterir. Bu yapısal gözlem, apo-Cas9’un DNA’yı spesifik olmayan bir şekilde bağladığını ve rakip RNA (kılavuz RNA veya heparin) varlığında spesifik olmayan bölgelerden hızla ayrılabileceğini gösteren DNA perdeleme deneyleri (DNA curtains assays) ile uyumludur. Apo-Cas9’un sgRNA’ya bağlı ve DNA’ya bağlı yapılarla yapısal olarak üst üste binmesi ayrıca enzimin apo durumunda katalitik olarak inaktif bir konformasyon benimsediğini ve DNA’nın tanınması ve bölünmesi için RNA ile indüklenen yapısal aktivasyonu gerektirdiğini gösterir. Bu yapısal bulgu, Cas9 enzimlerinin bağlı kılavuz RNA’lar yokluğunda nükleazlar olarak inaktif olduklarına ve ayrıca RNA kılavuzlu endonükleazlar olarak işlevlerini desteklediklerine dair biyokimyasal gözlemle tutarlıdır.

HNH (H840A) veya RuvC (D10A) domaininin mutasyona uğratılmasının Cas9’u bir nickaza dönüştürdüğü veya Cas9’un her iki nükleaz domaininin (sözde “ölü Cas9” veya dCas9) mutasyona uğratılmasının endonükleaz aktivitesini ortadan kaldırırken DNA bağlanma yeteneğinin devam ettiği görülmüştür.

CRISPR–Cas9 Efektör Kompleks Etkileşimi

Bölgeye özgü DNA tanıma ve kesim elde etmek için Cas9’un aktif bir DNA gözetim kompleksi oluşturmak için kılavuz RNA (doğal bir crRNA – tracrRNA veya bir sgRNA) ile birleştirilmesi gerekir. crRNA’nın 20 nt spacer dizisi, DNA hedef özgüllüğü sağlar ve tracrRNA Cas9 görevlendirmesinde çok önemli bir rol oynar.

Genetik ve biyokimyasal deneyler, hedef özgüllük için özellikle önemli olan crRNA’ların spacer bölgesi içinde RNA nükleotitlerinin sözde çekirdek sekansının rolünü tanımlamıştır. Tip II CRISPR sistemlerinde, çekirdek bölgesi, 20-nt spacer dizinin 3′ ucunda yer alan PAM-proksimal 10-12 nükleotid olarak tanımlanmıştır (Şekil 6). Bu çekirdek bölgesindeki uyumsuzluklar, hedef DNA bağlanmasını ve kesilmesini ciddi şekilde bozar veya tamamen ortadan kaldırır oysa çekirdek bölgesindeki yakın homoloji, başka yerlerdeki birçok uyumsuzlukla bile çoğu zaman hedef dışı bağlanma olaylarına yol açar.

Şekil 6. sgRNA ikincil yapısının şematik gösterimi

sgRNA Bağlamasına Göre Konformasyonel Yeniden Düzenleme

Cas9–sgRNA bağlanmasının ilkeleri ve hedef tanımadan önce kılavuz RNA düzenlemesi en iyi sgRNA’ya bağlı kristal yapıda gösterilmektedir. sgRNA’ya bağlı yapının apo-Cas9 ile karşılaştırılması, kılavuz RNA bağlamanın Cas9’u, daha düşük çözünürlüklü elektron mikroskobik çalışmalarının önerdiği gibi etkin olmayan bir konformasyondan DNA tanımaya yetkin bir konformasyona önemli bir yapısal yeniden düzenlemeye nasıl yönlendirdiğini tam olarak göstermektedir. En belirgin konformasyonel değişiklik REC lobunda, özellikle sgRNA bağlanması üzerine 65A° HNH alanına doğru hareket eden Hel-III’te gerçekleşir. Buna karşılık, Cas9, hedef DNA ve PAM dizisine bağlanma üzerine çok daha küçük yapısal değişiklikler sergiler, bu da kapsamlı yapısal yeniden düzenlemelerin çoğunun hedef DNA bağlanmasından önce gerçekleştiğini gösterir

Hedefin Aranması ve Tanınması

Cas9, kılavuz RNA’ya bağladığında, kompleks tamamlayıcı hedef DNA bölgelerini aramaya hazırdır. Hedef arama ve tanıma, hem 20-nt spacer sekans hem de hedef DNA’daki bir protospacer arasında tamamlayıcı baz eşleşmesini ve ayrıca hedef bölgeye bitişik korunmuş PAM sekansının varlığını gerektirir. PAM sekansı, hedef olan ve olmayan sekanslar arasındaki ayrım için çok önemlidir ve PAM’deki tekli mutasyonlar, in vitro Cas9 kesim aktivitesini devre dışı bırakabilir ve bakteriyofajların konakçı immün tepkisinden kaçmasına izin verebilir. Yaygın olarak kullanılan SpCas9 için doğal PAM dizisi 5′-NGG-3′ tür ve burada N, dört DNA bazından herhangi biri olabilir. Tek moleküllü deneyler, Cas9’un, potansiyel kılavuz RNA tamamlayıcılığı için çevreleyen DNA’yı sorgulamadan önce uygun bir PAM sekansı araştırarak hedef DNA araştırma sürecini başlattığını göstermiştir. Hedef tanıma, Cas9’un uygun PAM sekansını içermeyen DNA’dan hızla ayrıldığı üç boyutlu çarpışmalar yoluyla gerçekleşir ve bekleme süresi, uygun bir PAM mevcut olduğunda kılavuz RNA ile bitişik DNA arasındaki tamamlayıcılığa bağlıdır.

Cas9, uygun PAM ile bir hedef bölge bulduğunda, PAM’e bitişik çekirdeklenme bölgesinde yerel DNA ayrılmasını tetikler, ardından bir RNA-DNA melezi ve PAM proksimalinden PAM distal uçlarına kadar yer değiştirmiş bir DNA ipliği (R-halkası olarak adlandırılır) oluşturmak için RNA zinciri bağlanır. sgRNA’nın çekirdek bölgesi ile hedef DNA arasındaki mükemmel tamamlayıcılık, Cas9 aracılı DNA hedeflemesi ve bölünmesi için gereklidir, oysa çekirdek olmayan bölgedeki kusurlu baz eşleşmesi, hedef bağlanma spesifitesi için tolere edilebilir.

Hedef Kesimi

PAM tanıma ve ardından RNA-DNA dupleks oluşumu üzerine, Cas9 enzimi DNA kesimi için aktive edilir. Cas9, iki nükleaz domaini, üç bölünmüş RuvC motifinden oluşan iyi korunmuş bir RuvC domaini ve proteinin ortasında bulunan bir HNH domainini kullanır. Her domain, ağırlıklı olarak kör uçlu bir DSB üretmek için, hedef dsDNA’nın bir sarmalını, NGG PAM dizisinden keser. Cas9 nikazları (SpCas9 için D10A veya H840A), bununla birlikte, DNA dupleksinin yalnızca bir sarmalını keserek tek sarmallı bir kopmaya neden olur. Karşıt dizileri hedefleyen sense ve antisense sgRNA’larla eşleştirildiğinde, bu tür Cas9 nikazları, hedef DNA içinde kademeli kesikler yapabilir ve böylece, geliştirilmiş genom düzenleme özgüllüğü için çift nick ile indüklenmiş bir DSB oluşturabilir.

Sonuç olarak kapsamlı yapısal çalışmalar, Cas9 aracılı PAM tanıma ve hedef DNA bağlanması ve bölünmesinin moleküler mekanizmasına ışık tuttu ve Cas9’un onu bu kadar güçlü bir genom düzenleme aracı yapan hem yüksek verimliliğe hem de özgüllüğe nasıl sahip olabileceğini açıklamaya başladı. Bilgideki bu ilerlemelere rağmen, Cas9 tarafından DNA hedef tanımanın kesinliğini ve doğruluğunu kontrol eden faktörler ve istenmeyen hedef dışı bölünmeyi önleyen mekanizmalar hala tam olarak anlaşılmamıştır. Özellikle, DNA’nın metilasyon durumunun Cas9 hedeflemesi ve bölünmesi üzerinde hiçbir etkisi yok gibi görünse de, son çalışmalar, DNA hedef erişilebilirliğinin büyük ölçüde kromatin yapısından etkilendiğini göstermektedir. Transplante edilen CRISPR Cas9 yapısının ökaryotik genomik hedefini, sistematik bir yaklaşım kullanarak kromatin bağlamında özel olarak tanıdığı karmaşık süreci deşifre etmek, gelişmiş kılavuz RNA tasarımı ve Cas9 bağlanma veya bölünme bölgelerinin daha doğru hedef dışı tahminini mümkün kılar. Ayrıca, hedef DNA çözülmesine ilişkin tek moleküllü çalışmaları, CRISPR-Cas9 sistemlerinin hedefleme ve bölünme faaliyetlerinin altında yatan ayrıntılı mekanizmaları anlamamıza katkıda bulunmaya devam edecektir. Ayrıca Cas9 aracılı genom mühendisliğinin repertuarının, Cas9 ortologları tanımlanıp karakterize edildikten sonra büyük ölçüde genişletilmesi beklenmektedir. Toplu olarak, son yapısal ve mekanik çalışmalar yalnızca CRISPR-Cas9 mekanizmalarının temel bir anlayışını değil, aynı zamanda CRISPR-Cas9 verimliliğini artırmayı ve insan sağlığı ve terapötikler için hedef dışı etkileri en aza indirmeyi amaçlayan yapı tabanlı rasyonel tasarım için bir çerçeve sağlar.

Referans:

• Fuguo Jiang and Jennifer A. Doudna, CRISPR–Cas9 Structures and Mechanisms, Annual Review of Biophysics, 2017, 46:1, 505-529.