Southern blotting, birçok DNA molekülü arasından spesifik bir DNA sekansını tespit etmek için kullanılan bir laboratuvar tekniğidir. Bu tekniği Edward Southern bulduğu için adı Souther Blot olarak bilinmektedir. Bir laboratuvar prosedürü olarak Southern blot, ilgelinilen belirli bir DNA dizisini tanımlamak için bir organizmanın genomu olarak da bilinen toplam DNA’sını analiz etmek için kullanılabilir.

Southern blot ilk adımı, DNA restriksiyon enzimi adı verilen bir enzim kullanılarak küçük parçalara ayrılarak hazırlanır. Enzimle kesilen DNA fragmanlarının karışımı daha sonra jel elektroforezi adı verilen bir teknikle boyuta göre ayrılır. Jelde boyutuna göre ayrılan çift sarmallı DNA parçaları, jel içindeki tek sarmallara denatüre edilir veya ayrılır. Daha sonra, DNA fragmanları jelden bir blotlama zarına aktarılır. Bu adım tekniğe “Southern blotting” adını veren şey olmasına rağmen, terim tipik olarak tüm prosedürü tanımlamak için kullanılır. Blotlama membranına aktarım tamamlandığında, membran başlangıçta jel üzerindeki tüm bantları taşır. Membran daha sonra, numunedeki belirli bir DNA sekansını tamamlayıcı bir sekansa sahip olacak şekilde tasarlanmış, prob adı verilen küçük bir DNA parçası ile muamele edilir; bu, probun zar üzerindeki belirli bir DNA fragmanına hibridizasyonunu veya bağlanmasını sağlar. Ek olarak, prob tipik olarak bir radyoaktif atom veya bir flüoresan boya olan bir etikete sahiptir. Böylece, hibridizasyonu takiben DNA probu, birçok farklı DNA fragmanı arasından ilgilenilen DNA fragmanının zar üzerinde saptanmasına izin verir (Şekil 1).

Şekil 1. Genel hatlarıyla Souther blot analizinin aşamaları

Sonuç olarak Southern Blot, moleküler biyolojide kullanılan hibridizasyon yöntemlerinden biridir. Southern blot yöntemi, uygun probların kolaylıkla elde ediliyor olması ve araştırmacının çalıştığı özel bir genin, bu geni klonlamaya gerek kalmaksızın analizine olanak sağlamıştır.

Southern blot analizi neyi gösteriyor?

Southern blot analizi:

• DNA’nın kimliğini
• DNA’nın boyutunu
• DNA’nın çoğulluğunu belirlenmesini sağlar.

Southern blot için ne kadar DNA gerekiyor?

• Gereken DNA miktarı, probun büyüklüğüne ve spesifik aktivitesine bağlı olarak değişmektedir.

Deney basamaklarına detaylı bir şekilde bakalım:

1. DNA izolasyonu

Öncelikle üzerinde çalışılacak DNA çeşitli dokulardan (saç, semen, tükürük, bakteri, virus, parazit vb.) saf olarak izole edilir. DNA’ izolasyonu için bir çok yöntembulunmaktadır. Araştırıcı kendi becerisine ve laboratuvar olanaklarına göre en uygun olanlardan birini tercih edebilir. İzole edilen DNA’nın konsantrasyonu spektrometrik veya elektroforetik yöntemlerin biri ile belirlenir. Ayrıca saflığı da kontrol edilir. Souther blot tekniği yüksek kalitede ve yüksek moleküler ağırlıkta genomik DNA gerektirir (örneğin 20 kb).

Şekil 2. DNA izolasyon basamakları

2. Spesifik Restriksiyon enzimleri ile kesim

Hedef DNA saf olarak elde edildikten sonra ependorf tüpüne konur. Bunun üzerine, kesim için kullanılacak restriksiyon endonükleaz enziminden, tam bir kesim omasını sağlayabilecek miktarda ilave edilir ve uygun bir süre inkübasyona bırakılır. Restriksiyon enzimleri olarak EcoRI, Hind III, BamHI, vs. bulunmaktadır. Eğer gerekirse çalışmaya uygun olarak iki veya daha fazla enzim de kullanılabilir. DNA örneği ile enzim optimum sıcaklıkta (genellikle, 37°C’de 4-6 saat kadar) inkubasyona bırakılır. Bu süre içinde enzim, DNA’yı belli bazlardan keserek, küçüklü-büyüklü çok sayıda DNA fragmenti meydana getirir.

Şekil 3. Restriksiyon enzimleri DNA’yı spesifik yerlerden keserek farklı uzunlukalrda DNA parçaları oluştururlar.

3. Kesilen DNA fragmentlerin elektroforezi

Enzimle kesilen DNA örnekleri agaroz jele (PAGE’ de olabilir) yüklenerek uygun bir süre 40-50 volt altında elektroforez işlemi uygulanır. Bu işlem sırasında fragmentler büyükten küçüğe doğru bir sıralama ile bantlar oluştururlar. Bu aşamada jel üzerinde oluşan bantlar ethidium bromide ile boyanarak U V-ışığında görüntülenebilir ve bantlar, markör DNA ile karşılaştırılarak değerlendirilirler. Eğer başlangıçta iyi bir kesim yapılmışsa 20 kb’dan büyük 100’e yakın bant meydana gelebilir.

Şekil 4. Restriksiyon enzimleriyle kesilen DNA örnekleri jele yüklenir ve boyutlarına göre ayrılır.

4. Bantların membran üzerine transferi (Souther blotting)

Agaroz jel (veya PAGE)  üzerinde bulunan bantların naylon veya nitroselüloz membran üzerine transferleri yapılır. Bu işlem, elektro transfer, alkali kapillarite veya diğer geliştirilmiş yöntemlerin biriyle kolayca yapılabilir. Nitroselüloz membran yerine, yakın zamanlarda naylon membranlar daha fazla tercih edilmektedirler. Bunun başlıca nedenleri arasında, naylon membranlar daha sağlam, birim alanda daha fazla DNA adsorbsiyonu sağlamakta, DNA’nın fiksasyonu daha kuvvetli olmakta ve membran iyice yıkanıp temizlendikten sonra tekrar kullanılabilme olanağı bulunmaktadır.

Southern bloth düzeneği şekilde görüldüğü gibi tampon bulunan bir sıvı içinde altta tamponu geçirebilen bir sünger , onun üstünde DNA’nın yürüdüğü agaroz jel , üstünde DNA’nın aktarılacağı naylon membran ve en üstte suyu kendine doğru çekebilen kağıt peçeteler bulunur. İsteğe göre kağıt peçetelerin üzerine ağırlık konabilir.

DNA parçalarının naylon membrana akatarılması işlemi şu şekilde olmaktadır: öncelikle naylon membranın üzerine konan kağıt peçeteler suyu kendine doğru çeker ve bu sırada agaroz jel üzerinde bulunan DNA parçaları tampondaki Na iyonlarının etkisiyle naylon membrana doğru itilir. (+) yüklü olan membran (-) yüklü DNA parçalarını kendine bağlar. Böylece DNA naylon membrana aktarılmış olur.

Şekil 5. Bantların naylon membran üzerine transferi

5. Denatürasyon ve fiksasyon

Naylon üzerine transfer edilen DNA bantları kurutulur ve 0.5 N NaOH ile muamele edilerek denatüre edilir (çift iplikçik DNA, bazlar arası bağlar koparak tek iplikçik hale gelir). Bu aşamadan sonra naylon membran, 80°C’ye kadar ısıtılarak, tek iplikçiklerin membran üzerine fikse edilmesi sağlanır. Fiksasyonu sağlamlaştırmak için tespit işlemi vakum içinde yapılır.

Son zamanlarda gerek denatürasyon ve gerekse fikzasyonda daha değişik metotlar da kullanılmakladır. Bazı protokollerde membrana aktarım yapmadan denatürasyon yapılmaktadır.

6. Hibridizasyon

Naylon membran önce, pre-hibridizasyon solusyonu içinde 60-65°C’de 2-4 saat kadar inkübe edildikten sonra yıkanır. Eğer bu ön muamele yapılmazsa, problar tüm membran üzerine bağlanarak filmin tamamının siyah görünmesine neden olur. Bu aşamadan sonra, membran üzerine işaretli DNA prob (veya RNA prob) ilave edilir. Problar Fosfor-32 (P32) (veya biotinle) işaretli olabilir. Membran üzerine konulan tek iplikçik ve işaretli prob, kendine komplementer olan tek iplikçik hedef DNA segmenti ile non-kovalent bağlarla karşılıklı olarak birleşir ve çift iplikçik DNAxDNA dimeri (eğer RNA prob kullanılırsa DNAxRNA) oluşur (hibridizasyon). Bu işlem bir gece kadar sürdükten sonra, membran yıkanarak, birleşmemiş olan tek iplikçik hedef DNA sekansları ve bağlanmamış olan tek iplikçik problar uzaklaştırılır ve böylece membran üzerinde sadece çift iplikçik fragmanlar kalmış olur.

Şekil 6. Membran üzerinde probların hedef dizilerle hibridize olması

7. Otoradyografi

Naylon membran üzerine, X-ışınlarına duyarlı bir film (Kodak XAR-2) kapatılarak -70°C’de bir gece tutulur ve radyoaktivitenin film üzerine etkilemesi sağlanır. Bu sürenin sonunda film banyo edilir. Bu film üzerinde, işaretli problarla birleşmiş hedef DNA sekanslarının bulunduğu bölgeler siyah renkte görülürler. Bu bölgeler, aranılan etkene ait spesifik genin lokalize olduğu yerleri ifade eder. Böylece, aranılan hedef gen bulunur ve teşhis konulur.

Eğer Probları işaretlemede biotin kullanılmışsa, avidin, peroksidaz ve kromojen madde yardımı ile oluşan renk değişikliği, aranılan hedef DNA segmentinin bulunduğu yerleri gösterir.

Şekil 7. Otoradyografi sonucu elde edilen bant profilleri

Yukarıda aşamaları anlatılan Southern blotting tekniğinde iyi yetişmiş teknik elemana, çok fazla ve duyarlı malzemeye ihtiyaç duyulduğu gibi, en önemlisi spesifik etkenin izolasyonuna ve saf olarak üretilmesine gerek vardır. Bu da zaman alan ve klasik yöntemlerle gerçekleştirilen önemli bir ön aşamadır. Ayrıca, çapraz reaksiyonları önlemek için, probların çok spesifik olmaları da önemlidir. 

Kaynakça:

• C. Neal Stewart Jr. (Editor), Plant Biotechnology and Genetics: Principles, Techniques, and Applications, 2nd Edition, ISBN: 978-1-118-82012-4, March 2016
• Southern Blot-1
• Southern Blot-2
• Southern Blot-4
• Southern Blot-5