Klonlama vektörünü yabancı bir DNA fragmanı ile birleştirmek için restriksiyon enzimleriyle muamele edildiğinde, bazı zorluklar ortaya çıkar. Bunlardan biri restriksiyon enzimleri ile kesilen klonlama vektörünün yapışkan uçlarının, yabancı DNA ile birleşmek yerine kendi vektörünün yapışkan ucuna bağlanması ve yeniden halkasal hale gelmesidir. Bu sorunu çözmek için, kesilmiş vektör (yani restriksiyon enzimleri ile muamele edilmiş plazmid), terminal 5′ fosforil grubunu çıkaran bir enzim olan alkalin fosfataz ile muamele edilir. 5′ uçtan fosfat grubu ayrılınca vektörün uçları kendi kendine birleşemez ve lineer halde kalır. Klonlanacak yabancı DNA, restriksiyon enzimleri ile muamele edildikten sonra alkalin fosfataz ile muamele edilmez. Bu nedenle, yabancı DNA fragmanının 5′ ucu plazmidin 3′ ucuna kovalent olarak birleşebilir (Şekil 1).

Şekil 1. Alkalin fosfataz uygulaması. Alkalin fosfataz ile muamele edilen plazmidin uçları artık kendi kendine birleşemez. Böylece plazmit lineer halde kalır. (Nick: çift sarmallı bir DNA molekülünde, tipik olarak hasar veya enzim etkisiyle bir sarmalın bitişik nükleotitleri arasında fosfodiester bağının bulunmadığı bir süreksizliktir.)

Elde edilen hibrid veya rekombinant DNA, 3′ ve 5′ hidroksi uçlu bir nick’e sahiptir. DNA ligaz yabancı DNA molekülünün 3′ hidroksil ucu ile vektörün 5′ fosfat ucu arasında bir fosfodiester bağı oluşturmaktır (Şekil 2). Bu nedenle, alkalin fosfataz ve ligaz, vektörün yeniden sirkülasyonunu önler ve rekombinant DNA moleküllerinin üretim sıklığını arttırır. Oluşan rekombinant DNA’nın iki 3′ ucu ile vektör DNA arasındaki nickler (çentikler), dönüşüm sırasında bakteriyel konakçı hücrelerinin içinde onarılır.

Şekil 2. DNA Ligaz enziminin DNA zincirindeki 3′ hidroksil ucu ile 5′ fosfat ucu arasında bir fosfodiester bağ oluşturması ve iki zinciri birleştirmesi.

Özellikle vektör tek bir restriksiyon enzimi ile kesilirse, vektörün eklenen DNA fragmanından ziyade kendi üzerine bağlanma ihtimali çok yüksektir. Bu durum, yüksek oranda boş klonlama vektörleri ile sonuçlanır. Yapışkan uçları gidermede dana intestinal alkaline fosfataz enzimi, bakteriyel alkalin fosfataz enzimine tercih edilmektedir. Bu enzim DNA segmentinin iki ucundaki fosfat moleküllerini (5′-P) çıkararak resirkülarizasyonu önler. Bu enzimle sadece vektör DNA muamele edilir, genomik DNA segmentlerine uygulanmaz.

Alkalin fosfataz tarafından fosfatı uzaklaştırılan 5′ uçlar DNA ligaz tarafından ligasyona tabi tutulamaz. Yani DNA ligaz bu uçları birleştiremez. Alkalin fosfataz uygulaması “boş” klonların oluşmasını >%95 oranında etkili bir şekilde azaltır.

Kaynaklar:

• Alkalin Fosfataz
• Defosforilasyon-1
• Defosforilasyon-2
• ARDA M., Biyoteknoloji (Bazı Temel İlkeler), KÜKEM Derneği Bilimsel Yayınlar No.2, 2. Baskı, ANKARA