Cpf1(Cas12a), Cas9‘a benzer bir RNA kılavuzlu nükleazdır. T bakımından zengin bir PAM bölgesini (TTTN), kılavuzun 5′ ucu tarafında tanır. Bu onu 3’ ucu tarafında bir NGG PAM kullanan Cas9’dan farklı kılar. Cpf1’in yaptığı kesim kademeli (staggered cut) bir kesimdir. AsCpf1 ve LbCpf1 hedeflenen (+) dizide PAM’den 19 bp sonra (-) dizide 23 bp sonra keser (Şekil 1).

Şekil 1. Cpf1’in kesim bölgesi

CRISPR-Cpf1, araştırmalarda ve terapötik uygulamalarında önemli etkileri olan ve Cas9’dan birkaç önemli şekilde farklıdır. Bunlarda birincisi, Cas9 doğal formunda (herhangi bir genom mühendisliğine uğramamış formu), DNA’yı kesmek için her ikisi de kesme aktivitesi için gerekli olan iki küçük RNA’ya (tracrRNA ve crRNA) sahip bir kompleks oluşturur. Cpf1 sistemi sadece tek bir RNA (crRNA) gerektirdiğinden daha basittir. Cpf1 enzimi ayrıca standart SpCas9’dan daha küçüktür, bu da hücrelere ve dokulara aktarılmasını kolaylaştırır.

İkincisi ve belki de en önemlisi, Cpf1 DNA’yı Cas9’dan farklı bir şekilde keser. Cas9 kompleksi DNA’yı kestiğinde, her iki ipliği de aynı yerden keserek, tekrar birleştirildiklerinde sıklıkla mutasyonlara maruz kalan ‘kör uçlar’ oluşturur. Cpf1 kompleksi ile, iki iplikçikteki kesikler kaybolur ve açıkta kalan uçlarda yapışkan uç denilen kısa çıkıntılar (staggered cut) oluşur. Bu durum ekleme çalışmalarına hassasiyet konusunda yardımcı olması ve araştırmacıların bir DNA parçasını daha verimli ve doğru bir şekilde entegre etmelerini sağlar (Şekil 2).

Şekil 2. Cpf1 ve Cas9 nükleazlarının kesimi sonucu oluşan uçlar

Üçüncüsü, Cpf1, tanıma bölgesinden uzak yerde kesim yapar, yani hedeflenen gen kesim yerinde mutasyona uğrasa bile, muhtemelen yeniden kesilebilir ve doğru düzenlemenin gerçekleşmesi için birden fazla fırsata olanak tanıyabilir.

Dördüncüsü, Cpf1 sistemi hedef bölgeleri seçmede esneklik sağlar. Cas9 gibi, Cpf1 kompleksi önce PAM olarak bilinen kısa bir sekansa bağlanmalıdır ve bunun için doğal olarak oluşan PAM sekanslarına bitişik hedefler seçilmelidir. Cpf1 kompleksi, Cas9’dan çok farklı PAM sekanslarını tanır. Bu canlı genomunu hedeflemede bir avantaj olabilir. Örnek olarak CTA PAM sekansınıda etkili bir şekilde tanıyabilir.

İki Cp1 familyası proteinin, AsCpf1 (Acidaminococcus’tan) ve LbCpf1’in (Lachnospiraceae’den), insan hücrelerinde etkili bir şekilde genom düzenlemesi gerçekleştirdiği gösterilmiştir.

Sonuç olarak:

1. Cpf1, kesim aktivitesi için sadece bir crRNA gerektirir ve ayrıca bir tracrRNA’ya ihtiyaç duymaz.
2. Cpf1’in yaptığı kesim kademeli (staggered cut) bir kesimdir ve yapışkan uçlar oluşturur.
3. Cpf1, tanıma bölgesinden uzak yerde kesim yapar ve buda birçok olanak sağlar.
4. Cpf1 kompleksi, Cas9 gibi tek bir spesifik PAM dizisi değil farklı PAM sekanslarını da tanıyabilir.

Kaynakça:

• Zaidi SS, Mahfouz MM, Mansoor S. CRISPR-Cpf1: A New Tool for Plant Genome Editing. Trends Plant Sci. 2017;22(7):550-553. doi:10.1016/j.tplants.2017.05.001
• Zetsche, Bernd et al. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. 2015. Cell, Volume 163, Issue 3, 759 – 771. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038
• Cpf1-1
• Cpf1-2