Yeşil floresan protein (GFP), proteinlerin hücre içi lokalizasyonunu tanımlamak ve gen ekspresyonunu izlemek için güçlü bir araçtır. GFP, herhangi bir ekzojen eklenmiş substrat veya kofaktör olmadan, mavi ışıkla uyarıldığında güçlü bir yeşil floresan üretebilir. Canlı hücre içindeki olaylar böylece invaziv olmayan bir şekilde görselleştirilebilir. Saccharomyces cerevisiae için, ilgilenilen proteinin N-terminali ve C-terminaline füzyon proteinlerinin ekspresyonu içeren bir plazmid (pUG) geliştirilmiştir. pUG vektörleri, bu mayadaki lokalizasyon ve ekspresyon çalışmaları için yararlı olmuştur.

Son zamanlarda, GFP’den farklı bir dalga boyuna sahip ışık yayan flüoresan proteinler geliştirilmiştir. Bu proteinler GFP’nin mavi, siyan ve sarıya kaymış mutantlarını ve yeni izole edilmiş dsRed’i içerir. dsRed, kırmızı ışıma yayan bir floresan proteindir. dsRed, mercan Discosoma’dan türetilmiştir. Bundan dolayı dsRed olarak adlandırılmaktadır. dsRed, emisyonu maksimum 583 nm olan turuncu-kırmızı bir floresana sahiptir. Biyofiziksel ve X-ışını kristalografik çalışmaları, dsRed’in kararlı bir tetramer oluşturduğunu ve her monomerin yapısal olarak GFP’ye çok benzediğini ortaya koymuştur. dsRed floresan, 558 nm’de en iyi şekilde uyarılır, ancak standart 488 nm’lik bir lazerle de uyarılabilir, bu da dsRed’in lazer bazlı konfokal mikroskoplar ve akış sitometreleriyle kullanılmasına izin verir. dsRed yüksek bir kuantum verimine sahiptir ve fotostabilidir. Bu özellikler dsRed’i özellikle GFP ve varyantlarını içeren çok renkli deneyler için floresan görüntüleme için ideal bir aday yapar. dsRed’in kodon optimizasyonu yapılmış bir sürümü artık dsRed1 adı altında mevcuttur.

Bu avantajlara rağmen, yabani tip dsRed’in floresan raportör olarak kullanım için çeşitli sorunları vardır. dsRed başka bir proteine kaynaştığında, dsRed alanının tetramerizasyonu proteinin işlevini ve lokalizasyonunu bozabilir. dsRed tetramer aynı zamanda daha yüksek mertebeden agregatlar oluşturmak için kendi kendine birleşir. Belki de dsRed ile ilgili en ciddi sorun, kromofor olgunlaşmasının yavaş olması ve oda sıcaklığında yarılanma ömrünün 24 saat saatten fazla olmasıdır.

Yeni sentezlenen dsRed, GFP’de bulunan aynı kromoforu oluşturarak koyu yeşil bir flüoresans geliştirir. Daha sonra ikinci bir oksidasyon reaksiyonu kırmızı kromofor üretir. Bu yavaş olgunlaşma, başlangıçtaki yeşil türlerin floresansının arttırıldığı “floresan zamanlayıcı” olarak adlandırılan bir dsRed varyantı ile kullanılmaya başlanmıştır. Bununla birlikte, çoğu uygulama için dsRed’in yavaş olgunlaşması zararlıdır. GFP ile çift etiketli görüntülemede, dsRed’in ilk yeşil floresanı GFP kanalında kontaminasyon üretir. Daha genel olarak, kırmızı floresanın yavaş gelişmesi, özellikle maya gibi hızla büyüyen organizmalarda, dsRed sinyalinin yoğunluğunu sınırlar. dsRed2 olarak adlandırılan bir varyant, DsRed1’den daha hızlı olgunlaşır, ancak DsRed2, tam flüoresans elde etmek için hala uzun saatler gerektirir.

Şekil 1. DsRed varyantlarının normalleştirilmiş uyarma ve emisyon spektrumları. (A) N42 mutasyonu DsRed’in spektral özelliklerini değiştirir. Spektrumlar DsRed1 ve N42H ve N42Q varyantları için gösterilmiştir. Üç proteinin tamamı tamamen olgunlaşmıştır. (B) Optimize edilmiş DsRed.T3 ve DsRed.T4 varyantlarının spektrumu

Yapılan optimizasyon çalışmaları sonunda dsRed.T3 ve dsRed.T4 olarak adlandırılan bir çift optimize edilmiş varyant elde edilmiştir. dsRed.T3 hızla olgunlaşır ve saflaştırılmış protein neredeyse olgun yabani tip dsRed kadar parlaktır (Tablo 1), bu varyantı kırmızı floresanın tek renkli görüntülemesine çok uygundur. dsRed.T3, yabani tip dsRed’den (Şekil 1B) daha yüksek bir mavi uyarım zirvesine ve biraz daha yüksek bir yeşil emisyon zirvesine sahiptir, bu da çift renkli deneylerde GFP sinyalinin bir miktar kontaminasyonuna neden olur. Bununla birlikte, bu kontaminasyon genellikle azdır. dsRed.T3’ün arttırılmış mavi uyarımı, örneğin, floresan 488 nm’lik bir lazerle uyarılıyorsa, aslında avantajlı olabilir. dsRed.T4, yabani tip dsRed’inkine çok benzeyen floresan spektrumlarına sahiptir (Şekil 1B) ve GFP sinyalinin ihmal edilebilir kontaminasyonunu verir. Saflaştırılmış dsRed.T4, dsRed.T3’ün sadece yarısı kadar parlak olmasına rağmen, bu etki in vivo olarak kısmen dengelenmiştir, çünkü dsRed.T4, dsRed.T3’ten neredeyse iki kat daha hızlı olgunlaşır (Tablo 1). Bu nedenle, dsRed.T4 muhtemelen çoğu uygulama için en iyi varyanttır. dsRed.T1 esasen dsRed.T4 ile özdeştir (Tablo 1), ancak dsRed.T1 sistein kalıntılarından yoksundur ve bu nedenle salgı yolunun oksitleyici ortamında daha verimli katlanabilir.

Tablo 1. dsRed1, başlangıç kodonundan sonra bir valin eklenmesi haricinde yabanıl tip DsRed ile aynıdır. DsRed2 bu ekstra valinden yoksundur. Yabani tip DsRed’e göre, diğer varyantlar aşağıdaki değişiklikleri içerir, burada P (–4) L, başlangıç kodonunun yukarısındaki polylinker’da bir kodon değişikliğini gösterir.

dsRed2: R2A, K5E, K9T, V105A, I161T, S197A.

dsRed.T1: P(–4)L, R2A, K5E, N6D, T21S, H41T, N42Q, V44A, C117S, T217A.

dsRed.T3: P(–4)L, R2A, K5E, N6D, T21S, H41T, N42Q, V44A, A145P.

dsRed.T4: P(–4)L, R2A, K5E, N6D, T21S, H41T, N42Q, V44A, A145P, T217A.

b) Parlaklık, yok olma katsayısının çarpımı ve kuantum verimi ile belirlenmiştir.

Göreceli parlaklık, dsRed1’in parlaklığının 1.00 olarak tanımlanmasıyla hesaplanmıştır.

c) Olgunlaşma için yarı zamanlar, grafiksel olarak tahmin edilmiştir.

Listelenen değerler iki ayrı deneyin ortalamalarıdır; her bir DsRed varyantı için, iki deneyde elde edilen sayılar birbirinin %15’i dahilindeydi.

dsRed de yayılan ışığın daha uzun dalga boyuna sahip olması ışık saçılması ve hücrelerin otofloresanıyla ilişkili sorunları en aza indirmektedir.

Şekil 2. DsRed protein ışıması yapan S. cerevisiae hücreleri

Sonuç olarak, farklı emisyon renklerine sahip floresan proteinler, çeşitli olayların izlenmesine izin veren in vivo çoklu etiketleme deneyleri için çok değerlidir. Kırmızı floresan proteini dsRed, GFP ile çift renkli deneyler için ideal olan spektral özelliklere sahiptir. Ancak, yabanıl tip DsRed’in yavaş kromofor olgunlaşması ve zayıf çözünürlük de dahil olmak üzere çeşitli dezavantajları vardır. Yavaş olgunlaşmanın üstesinden gelmek için, yabanıl tip proteinden 10-15 kat daha hızlı olgunlaşan DsRed varyantları oluşturmak için rastgele ve yönlendirilmiş mutajenez kullanılmıştır.

42. pozisyondaki bir asparajin-glutamin değiştirilmesi, dsRed’in olgunlaşmasını büyük ölçüde hızlandırmıştır, fakat aynı zamanda yeşil emisyon seviyesini de arttırmıştır. Ek amino asit değişiklikleri, olgunlaşmayı daha da hızlandırırken bu yeşil emisyonu bastırmıştır. dsRed’in çözünürlüğünü arttırmak için proteinin N terminaline yakın net yükü azaltılıp optimize edilmiştir. Optimize edilmiş dsRed varyantları, maya gibi hızla büyüyen organizmalarda bile parlak floresan vermiştir. Yapılan optimizasyon çalışmalarıyla en iyi kullanılabilir dsRed proteini üretilmiştir.

Kaynakça:

• Bevis, B., Glick, B. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed). Nat Biotechnol 20, 83–87 (2002). https://doi.org/10.1038/nbt0102-83
• Rodrigues, F., van Hemert, M., Steensma, H. Y., Côrte-Real, M., & Leão, C. (2001). Red fluorescent protein (DsRed) as a reporter in Saccharomyces cerevisiae. Journal of bacteriology, 183(12), 3791–3794. https://doi.org/10.1128/JB.183.12.3791-3794.2001