Kızıl Kraliçe Hipotezi, organizmaların yok olmalarını önlemek için sürekli olarak parazitlere karşı yeni direnç mekanizmaları geliştirmeleri gerektiğini önermektedir. Parazitler, bu direnç mekanizmalarını atlatmak için karşı önlemler geliştirirler. Bu hayatta kalma savaşı, bakteri ve virüslerin ortak evrimsel dinamikleriyle izlenebilir. Bakteriler kendilerini faj istilasına karşı savunmak için birçok farklı strateji geliştirdiler; bunlar arasında, hedef DNA’yı keserek etkisiz hale getiren restriksiyon enzimleri, faj istilasının başarısız olmasına yol açan toksin-antitoksin modülleri ve belirli nükleik asit sekanslarını hedefleyip keserek inaktive eden CRISPR–Cas sistemleridir.

Fajlar bu savunma sistemlerinin üstesinden gelmek için çeşitli mekanizmalar geliştirmiştir. Bunlar:

• Restriksiyon enzim kesim bölgelerini değiştiren proteinlerin ekspresyonu veya restriksiyon enzimlerinin kofaktörlerini üretmek
• Faj istilasının başarısız olmasına yol açan toksin-antitoksin sistemlerinin aktivitesini inhibe eden antitoksin moleküllerini üretmek
• CRISPR–Cas sistemine doğrudan bağlanan ve etkisiz hale getiren proteinleri üretmek şeklindedir (Şekil 1).

Şekil 1. CRISPR-Cas ve anti-CRISPR sisteminin basit bir şeması

CRISPR–Cas sistemleri, bakteriye faj veya plazmid gibi ‘yabancı’ nükleik asitlerin istilasına karşı bir savunma mekanizması sağlar. Küçük CRISPR RNA (crRNA) molekülleri, Cas proteinlerini crRNA’nın komplementeri olan dizileri tanımak ve yok etmek için yönlendirir. CRISPR–Cas sistemleri, filogeni ve etki mekanizmalarına dayanarak altı türü kapsayan iki geniş sınıfa (Sınıf 1 ve Sınıf 2) ayrılır.

Tip I, III ve IV’ü içeren Sınıf 1 CRISPR–Cas sistemleri, hedeflenen nükleik asitlerin tanınması için çok alt üniteli Cas protein komplekslerini kullanır. Örneğin, tip I sistemlerinde antiviral savunma için CRISPR ile ilişkili kompleks (Cascade) yapısı vardır. Aksine, tip II, V ve VI’yı içeren Sınıf 2 CRISPR–Cas sistemleri, hedef tanıma ve nükleik asitleri kesme fonksiyonlarını yerine getiren tek bir efektör protein (Cas9 gibi) kullanır. Özellikle, tip II CRISPR-Cas9 sistemi genom düzenleme ve diğer biyoteknolojik uygulamalar için geniş çapta uyarlanmıştır.

CRISPR–Cas sistemlerinin güçlü ve uyarlanabilir doğasının, bakterilerde mobil genetik elementlerin yayılmasında güçlü bir engel oluşturması beklenebilir. Aktif bir CRISPR-Cas sistemine sahip bir bakteri hücresi yeni bir mobil genetik element ile karşılaştığında, küçük bir yabancı DNA parçasının (spacer-aralayıcı olarak bilinir) CRISPR dizisine dahil edilmesi yoluyla kendisini bağışık hale getirebilir. Aynı mobil genetik element ile tekrar karşılaşılırsa, yabancı olarak tanınacak ve yıkım için hedefleyecektir.

Mobil genetik elementler, aralayıcı hedefli dizilerinde (protospacer olarak bilinir) veya protospacer bitişik motifinde (PAM) mutasyonların birikmesi yoluyla CRISPR-Cas sistemleri tarafından tanınmaktan kaçabilir. Bununla birlikte, bakteriyel bir popülasyonda farklı hücreler tarafından rastgele elde edilen yeni aralayıcıların çeşitliliği nedeniyle, fajlar, sadece rastgele mutasyonla sürekli bir ortak kültürde CRISPR–Cas hedeflemesinden tamamen kaçamazlar. Buna ek olarak, birkaç tip I CRISPR-Cas sisteminin, primer adaptasyon olarak bilinen bir işlem yoluyla kendilerini kaçış mutantlarına karşı yeniden bağışıklık kazandırmak için hızla yeni aralayıcılar aldığı gösterilmiştir.

CRISPR–Cas inhibitörlerinin keşfi

CRISPR-Cas sistemlerinin aktif inhibitörlerinin ilk örnekleri, Pseudomonas spp. fajında ​​keşfedilmiştir. Sekans analizleri ile bu ‘anti-CRISPR‘ fenotipinden sorumlu genomik bölge saptanmıştır ve ilgili genleri tanımlanmıştır. Toplamda beş farklı proteinin (AcrF1, AcrF2, AcrF3, AcrF4 ve AcrF5) tip I‑F CRISPR-Cas sistemini inaktive ettiği gösterilmiştir (Şekil 2). Bu proteinlerin hiçbiri, cas genlerinin ekspresyonunu veya olgun crRNA moleküllerinin üretimini bozmadığı için, CRISPR–Cas sistemini doğrudan bloke etmedikleri varsayılmıştır. Başka bir çalışmada, dört ek küçük protein ailesinin (AcrE1, AcrE2, AcrE3 ve AcrE4) P. aeruginosa‘nın tip I-E CRISPR-Cas sistemini inhibe ettiği gösterilmiştir.

Şekil 2. Tip I‑F anti-CRISPR proteininin etki mekanizması. CRISPR lokusu kopyalanır ve Cascade olarak bilinen bir ribonükleoprotein kompleksi oluşturmak için Cas proteinleri ile birleştirilen olgun crRNA’lara işlenir. Cascade, crRNA’ya komplemeter sekanslar arayarak hücreyi tarar. Bir eşleşme bulunduğunda, Cas3 nükleaz komplekse alınır ve hedef DNA kesilerek parçalanır (gösterilmemiştir). AcrF1 (iki sarı küre olarak gösterilmiştir) ve AcrF2 (mor küre olarak gösterilmiştir), sırasıyla Cascade proteinleri Cas7f ve Cas8f Cas5f ile etkileşir ve DNA hedefine bağlanmayı inhibe eder. AcrF3 (mavi bir üçgen olarak gösterilmiştir) Cas3 nükleazına bağlanır ve hedef DNA’nın kesilmesini önler.

Başlangıçta keşfedilen dokuz anti-CRISPR protein ailesi, diğer türlerde bulunabilen ve/veya diğer CRISPR-Cas tiplerine karşı aktif olabilecek yeni anti-CRISPR proteinlerinin keşfine yol açabilecek herhangi bir ortak dizi motifini paylaşmıyordu. Bununla birlikte, bu proteinleri kodlayan genlerin genomik bağlamı çok benzerdi. Anti-CRISPR proteinlerini kodlayan fajlar, anti-CRISPR genlerinin downstream bölgesinde bir sarmal dönüşlü sarmal (helix–turn–helix) motif içeren anti-CRISPR ile ilişkili 1 (Aca1; anti-CRISPR associated 1, aca1 tarafından kodlanan) olarak bilinen bir transkripsiyonel regülatörü de kodluyordu. Buna karşılık, anti-CRISPR genleri olmayan fajlarda da aca1 yoktu. Bu regülatörün işleviyle ilgili araştırmalar hala devam etmekle birlikte, anti-CRISPR genleri ve aca1 tek bir operon oluşturur ve Aca düzenleyici proteinin faj enfeksiyon döngüsü sırasında optimal aktivite için anti-CRISPR ve aca genlerinin ekspresyonunu kontrol ettiği görülmektedir.

Aday olan anti-CRISPR genlerinin homologları, Aca1’den farklı bir dizi ailesinden bir sarmal-dönüş-sarmal proteinini kodlayan bir genin upstream kısmında gözlendi. Buna karşılık, bu yeni Aca proteinleri ailesi (Aca2) ek aday anti-CRISPR genlerinin tanımlanmasına yol açtı. Bu çalışma tip I‑F anti-CRISPR proteinlerinin (AcrF6, AcrF7, AcrF8, AcrF9 ve AcrF10) beş yeni ailesini ortaya çıkardı ve işlevsel olarak doğrulandı.

Daha sonra tip II CRISPR-Cas sisteminin ilk inhibitörleri keşfedildi. Üç küçük protein ailesinin (AcrIIC1, AcrIIC2 ve AcrIIC3) Neisseria meningitidis‘in tip II‑C CRISPR–Cas9 aktivitesini hem doğal bakteri ortamında hem de kültüre edilmiş insan hücrelerinde bir genom düzenleme aracı olarak kullanıldığında bloke ettiği gösterilmiştir. Başka bir çalışmada Listeria monocytogenes tip II‑A CRISPR-Cas sistemi inhibe eden dört yeni anti-CRISPR protein ailesi (AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3 ve AcrIIA4) keşfedildi . Bu anti-CRISPR proteinlerinden ikisinin, AcrIIA2 ve AcrIIA4’ün Streptococcus pyogenes‘in tip II‑A CRISPR-Cas9 proteinine karşı etkili olduğu gösterilmiştir.

Tablo 1. Anti-CRISPR protein aileleri

Anti-CRISPR proteinlerini kodlayan genler, myophages, siphophages, konjugatif elementlerde ve patojenite adalarında tanımlanmıştır. Anti-CRISPR genlerinin downstream bölgesinde bir aca geninin varlığı dışında ortak bir genetik özellikleri yoktur. Anti-CRISPR genleri, fajlarda hem kapsid hem de kuyruk morfogenetik genlerinin yakınında ve genomlarının aşırı uç kısmında yer aldığı bulunmuştur.

Anti-CRISPR proteinleri, inhibe ettikleri CRISPR Cas sisteminin tipine göre sınıflandırılır. Oluşturulan adlandırma kuralı, inhibe edilen sistemin tipini, protein ailesine atıfta bulunan sayısal bir değeri ve spesifik anti-CRISPR proteininin kaynağını içerir. Örneğin, AcrIIC1Nme tip II‑C CRISPR–Cas sistemine karşı aktiftir, bu sistem için tanımlanan ilk anti-CRISPR proteiniydi ve bir N. meningitidis genomunda entegre bir mobil genetik elementte kodlanmaktadır.

Kaynaklar:

• Pawluk, A., Davidson, A. & Maxwell, K. Anti-CRISPR: discovery, mechanism and function. Nat Rev Microbiol 16, 12–17 (2018). https://doi.org/10.1038/nrmicro.2017.120
• Zhang, F, Song, G, Tian, Y. Anti‐CRISPRs: The natural inhibitors for CRISPR‐Cas systems. Animal Model Exp Med. 2019; 2: 69– 75. https://doi.org/10.1002/ame2.12069