Hücre kültürünün sıkça tercih edildiği alanlar kanser, aşı çalışmaları, ilaç geliştirilmesi ve in vitro sitotoksisite çalışmalarıdır. Sitotoksik terimi, hücre ölümüne neden olan anlamına gelmektedir. Sitotoksisite araştırmaları, bir maddenin sitotoksik potansiyelinin olup olmadığının belirlenmesi amacıyla yapılır. Hücre temelli sitotoksisite çalışmaları, gerek uygulama kolaylığı, gerekse in vivo çalışmalardan elde edilen verilerle uyum göstermesi nedeniyle, hayvan deneylerine alternatif olarak doğmuş ve toksikoloji laboratuvarlarında sıkça tercih edilir hale gelmiştir. Sitotoksisite, incelenen maddenin dozuna ve maruziyet süresine bağlı olarak hücrelere değişik derecelerde zarar veren bir olaydır. Hücreler, sitotoksik maddeye maruz kalırsa apoptoz, otofaji ve nekroz gibi olaylar sonucu ölebilir ya da sitostazis nedeniyle proliferasyon özelliklerini kaybedebilirler. Hücre bazlı sitotoksisite çalışmaları ile test edilen maddenin sitostatik ve sitotoksik etkileri hakkında temel bilgi edinilir. Deneysel olarak kimyasal, biyolojik ya da fiziksel etkenlere maruz bırakılan hücrelerin, maruziyet sonrasındaki canlılıklarının belirlenmesi, bu çalışmaların önemli bir basamağıdır. Hücre canlılığının belirlenmesi için uygulanan çok sayıda test vardır. Yapılan sitotoksisite çalışmasının tipi ne olursa olsun, önemli olan çalışma sonundaki canlı/ölü hücre miktarının belirlenmesidir. Sitotoksisite belirleme metodları genel olarak kolorimetrik, lüminesans ve enzimatik yöntemlerdir. Kolorimetrik yöntemlerden bir tanesi MTT analizidir.

MTT analizi, hücre canlılığı, proliferasyonu ve sitotoksisitesinin bir göstergesi olarak hücresel metabolik aktiviteyi ölçmek için kullanılır. Bu kolorimetrik analiz, sarı tetrazolium tuzunun (3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromür veya MTT) metabolik olarak aktif hücreler tarafından mor renkli formazan kristallerine indirgenmesine dayanmaktadır (Şekil 1) .

Şekil 1. Sarı tetrazolium tuzunun (MTT) mor renkli formazan kristallerine indirgenmesi

Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) bağımlı hücresel oksidoredüktaz enzimlerinin sarı renkli MTT’yi mor renkli suda çözünmez formazana indirgeme yeteneğine dayanır. Dolayısıyla bu deney, canlı hücrelerin mitokondrilerinde oluşan dehidrojenazlar tarafından tetrazolium bileşiğinin suda çözünmeyen formazan kristallerine enzimatik dönüşümü yoluyla hücre canlılığını ölçer. Ancak endoplazmik retikulum gibi diğer organellerde bulunan indirgeyici ajanlar ve enzimler de söz konusudur.

MTT analizinde suda çözünmeyen mor renkli formazan ürününü çözündürmek için ortama bir çözücü (dimetil sülfoksit (DMSO), asitleştirilmiş etanol çözeltisi veya sodyum dodesil sülfat (SDS)) ilave edilir (Şekil 2). Bu renkli çözeltinin absorbansı, bir spektrofotometre ile belirli bir dalga boyunda (genellikle 500 ila 600 nm arasında) ölçülebilir. Elde edilen mor renkli çözelti ne kadar koyu olursa, canlı ve metabolik olarak aktif hücrelerin sayısı da o kadar fazla olur. MTT yöntemi, hücre proliferasyonunu ve canlılığını analiz etmek için kullanılan en yaygın yöntemlerden biridir.

Şekil 2. Formazan tuzlarına çözücü eklendikten sonra mor renki çözelti oluşur. Genellikle çözücü olarak DMSO kullanılmaktadır.

MTT endositoz yoluyla alınır ve mitokondriyal enzimlerin yanı sıra endozomal/lizozomal enzimler tarafından indirgenir ve daha sonra kristal benzeri MTT formazanlarını oluşturmak için hücre yüzeylerine taşınır. MTT’nin endositozunun belirgin bir lezyona ve hücre ölümüne neden olmadığı, ancak MTT’nin metabolizması ve ekzositozunun hücrelere önemli ölçüde zarar verebileceği gösterilmiştir. MTT, kaspaz-8, kaspaz-3 gibi apoptoz ile ilişkili faktörleri aktive edebilir veya MTT formazan kristallerinin ortaya çıkmasından sonra hücre içeriğinin dışarıya sızmasını hızlandırabilir. Bu nedenle, MTT yöntemi seçilirken bu kriterlerde göz önünce bulundurulmalıdır.

MTT analizinin ana avantajı, sitotoksisite testi için altın standarttır; dezavantajı, formazan kristallerine dönüşümün metabolik hıza ve mitokondri sayısına bağlı olmasıdır.

Kaynaklar:

• V. Kuete, O. Karaosmanoğlu, H. Sivas, 2017, Anticancer Activities of African Medicinal Spices and Vegetables, Medicinal Spices and Vegetables from Africa, Academic Press, Pages 271-297, ISBN 9780128092866, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-809286-6.00010-8.
• Tokur O., Akso A., In Vitro Sitotoksisite Testleri, Harran Üniv. Vet. Fak. Derg., 2017; 6 (1): 112-118
• MTT