LDH sitotoksisite t" /> LDH test" />
Bilim insanı @Bilim_insani_835

Sitotoksisite Testi: LDH

LDH (Laktat dehidrojenaz) sitotoksisite testi, hücresel sitotoksisiteyi belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlayan kolorimetrik bir testtir. LDH, birçok farklı hücre tipinde bulunan ve plazma membranının zarar görmesi üzerine hücre kültürü ortamına salınan sitosolik bir enzimdir. Ortamdaki hücre dışı LDH, laktat dehidrojenaz enziminin NAD+’nın NADH’ye indirgeme yoluyla laktatın piruvata dönüşümünü katalize ettiği bir enzimatik reaksiyonla ölçülebilir. Diyaforaz enzimi daha sonra bir tetrazolyum tuzunu (INT) 490 nm’de ölçülebilen kırmızı bir formazan ürününe indirgemek için NADH kullanır (Şekil 1).


Sitotoksisite Testi: LDH <h1>Sitotoksisite Testi: LDH</h1><p><br></p>

Şekil 1. LDH sitotoksisite testinin mekanizması


Formazan oluşumunun seviyesi, ortama salınan LDH miktarı ile doğru orantılıdır ve bu sitotoksisitenin bir göstergesidir. Bu test artık hazır kitlerle çok daha hızlı ve kısa sürelerde yapılabilmektedir. Bir örnek üzerinden kısaca hemen test basamaklarına bakalım.


Elimizde bir A maddesi olsun ve bu A maddesinin SK-MEL-30 İnsan Melanom hücrelerindeki sitotoksisitesine bakalım. Bunun için SK-MEL-30 hücrelerini 96 kuyucuklu plakaya ekilir. 24 saat sonra A maddesi belirlenmiş konsantrasyon aralıklarında (örneğin 10µM-1000µM) hücrelerin mediumuna eklenir. Uygulamadan 48 saat sonra hücrelerin mediumundan belli bir miktar alınır (bu miktar kullanılan kite göre farklılık gösterebilir) ve yeni bir plakaya aktarılır. Daha sonra üzerine reaksiyon karışımı eklenir. Bu reaksiyon karışımın içinde Diyoforaz enzimi olur ve şekil 1’de gösterilen reaksiyonun gerçekleşmesini sağlar. Solüsyon enzim aktivitesi için inkübasyon yapılır. Daha sonra enzinmatik reaksiyonun durması için durdurma solüsyonu eklenir ve 490nm ve 680nm de absorbans ölçümü yapılır (Şekil 2). Daha sonra hesaplama-analiz işlemi yapılarak A maddesinin sitotoksik olduğu konsantrasyon bulunur (Şekil 3).


LDH sitotoksisite testi prosedür şeması <p><strong style="color: rgb(0, 0, 0);">LDH sitotoksisite t

Şekil 2. LDH sitotoksisite testi prosedür şeması


Analiz sonucunda “yarı-maksimum inhibisyon konsantrasyonları’’ (IC50) belirlenir.


LDH testi sonrası elde edilen sonuç grafiği <p><strong style="color: rgb(0, 0, 0);">&nbsp;LDH test

Şekil 3. LDH testi sonrası elde edilen sonuç grafiği



LDH, birçok farklı hücre tipinde bulunan sitozolik bir enzimdir ve hücresel toksisitenin iyi bilinen ve güvenilir bir göstergesidir. Plazma zarının hasar görmesi, LDH’nin hücre kültürü ortamına salınmasına neden olur. Bu hücre dışı LDH, LDH’nin NAD+’nın NADH’ye indirgeme yoluyla laktatın piruvata dönüşümünü katalize ettiği birleştirilmiş enzimatik reaksiyonla ölçülebilir. Diyaforaz daha sonra bir tetrazolyum tuzunu (INT) 490 nm’de ölçülebilen kırmızı bir formazan ürününe indirgemek için NADH kullanır. Formazan oluşumu seviyesi, ortama salınan LDH miktarı ile doğru orantılıdır.


Kaynaklar: