Mavi-beyaz tarama testi, rekombinant bakterilerin tanımlanması için hızlı ve etkili bir tekniktir. E. coli‘de laktozu glikoz ve galaktoz şeklinde parçalayan bir enzim olan β-galaktosidazın aktivitesine dayanmaktadır.

E. coli‘nin bulunuduğu ortamda laktoz varlığı lacZ operonunu tetiklemektedir. Operon aktivitesi, laktozu metabolize eden β-galaktosidaz enziminin üretimiyle sonuçlanır. Klonlamada kullanılan çoğu plazmit vektörü, β-galaktosidazın ilk 146 amino asidi için kodlama bilgisini içeren kısa bir lacZ gen dizisine sahiptir. Kullanılan konakçı E. coli suşları lacZΔM15 delesyon mutasyonu içermektedir. Plazmid vektörü bu tür hücreler tarafından alındığında, fonksiyonel bir β-galatosidaz enzimi üretilir.

Bu sistem lac operonu kullanılarak geliştirilmiştir. Bunun için lac operonunun nasıl çalıştığını anlarsanız mekanizmayı daha iyi anlarsınız. lac operonunda Z, Y ve A yapısal genleri ve bunlarında hemen yanında operatör bölge denilen DNA dizileri yer almaktadır. Araştırmacılara göre lacI geni bir baskılayıcı molekül oluşturarak yapısal genlerin transkripsiyonunu regüle ediyor ve bu baskılayıcı allosterik bir moleküldür. Yani molekül başka bir moleküle tersinir olarak bağlanmakta ve hem üç boyutlu yapısını değişikliğe uğratmakta hem de kimyasal aktivitesini değiştirmektedir. Baskılayıcı, operatör bölgenin DNA dizisi ile etkileşime girer ve RNA polimeraz’ın işlevini engeller. Bu şekilde yapısal genlerin transkripsiyonu baskılanmış olur (Şekil 1A). 

Ortamda laktoz varsa, laktoz baskılayıcıya bağlanır ve onu konformasyonel değişikliğe uğratır. Bu değişiklik sonucunda baskılayıcının bağlanma bölgesi değiştiği için operatör DNA’ya bağlanamaz ve RNA polimerazın işleyişini engelleyemez. Böylece yapısal genlerin transkripsiyonu gerçekleşir ve laktoz metabolizması için gerekli enzimlerin sentezlenmesi sağlanır (Şekil 1B). Transkripsiyon yalnızca baskılayıcının operatör bölgeye bağlanamadığı zaman gerçekleştiği için burada negatif kontrol söz konusudur. Ortamda laktoz olmadığı zaman laktoz metabolizması için gerekli enzimlere gereksinim olmadığı için sentezlenmeleri baskılanır. Laktozun tümü metabolize olduğundaysa ortamda baskılayıcıya bağlanacak laktoz kalmaz böylece baskılayıcı engellenemez ve operatör bölgeye bağlanarak yapısal genlerin transkripsiyonunu baskılar (Şekil 1).

Şekil 1. Lac operonun çalışma prensibi

Şekil 2. Lac operonu ve β-galatosidaz



Klonlama deneylerinde kullanılan plazmid vektörler, bu mekanizmanın rekombinasyon için bir işaretçi olarak kullanılabileceği şekilde manipüle edilir (Şekil 3). Plazmid vektöründe lacZ dizisi içinde bir çoklu klonlama bölgesi (MCS) bulunur. Bu dizi, yabancı DNA’yı eklemek için restriksiyon enzimleri tarafından kesilebilir. Yabancı DNA içeren bir plazmid vektörü, konak E. coli tarafından alındığında fonksiyonel bir β-galatosidaz enzimi üretilemez. Yabancı DNA vektöre yerleştirilmezse veya MCS dışında bir konuma yerleştirilirse, plazmit vektöründeki lacZ geni, fonksiyonel bir β-galatosidaz enzimi üretir. Peki bu ne nasıl kullanılmaktadır?

Şekil 3. Mavi beyaz taramasında kullanılan örnek bir vektör plazmit



Mavi-Beyaz tarama sistemi nasıl çalışır?

Klonlanmak istenen gen klonlama vektörüne ligasyon işlemi ile aktarılır. Bu aşamada bazı vektörlere klonlanmak istenen gen eklenirken bazı vektörlere eklenmeyecektir. Daha sonra ligasyon ürünü olan plazmitler (ligasyon olan ve olmayan reaksiyon karışımı) E. coli konakçı hücresine aktarılır. Aktarım sırasında birçok yöntem vardır. Bunlara elektroporasyon ve ısı-şoku örnek verilebilir. Vektör aktarılan E.coli hücreleri IPTG+X-Gal ve seçici antibiyotik içeren (kullanılan plazmite göre değişebilir ama genelde ampisilin) agar üzerine ekilir.

Ekilen bakteriler agarda koloniler oluşturur. Fakat koloniler mavi ve beyaz renkte olacaktır. Çünkü lazZ geninin içine bizim çoğaltmak istediğimiz gen girmişse işlevsel β-galatosidaz enzimi üretilemeyecektir. β-galatosidaz üretilemeyince agardaki X-Gal parçalanarak mavi renkli ürün oluşturamaycaktır. Bunun yerine beyaz koloniler oluşturacaktır. Bu renk farkından istediğimiz genin plazmite başarılı bir şekilde girdiğini anlayacağız (Şekil 4).

Eğer genimiz lacZ geninin içerisine yerleşmemiş ise işlevsel bir β-galatosidaz enzimi üretilecektir. Oluşan β-galatosidaz agardaki X-Gal’i hidrolize edecektir ve mavi renkli koloniler oluşturacaktır. Bu renk farkından istediğimiz genin plazmite başarılı bir şekilde girmediğini anlayacağız (Şekil 4).

Şekil 4. Mavi beyaz testi tarama aşamaları özeti

Oluşan beyaz renki kolonilerden seçilerek bakteriler sıvı besiyerinde çoğaltılarak bakterilerden plazmit izolasyonu yapılabilir. Daha sonrasında elde edilen çoğaltılmış plazmitten çalışmanın amacına göre farklı işlemler yapılabilir.

Şekil 5. Test sonucunda bakterilerin oluşturduğu mavi ve beyaz renkli koloniler

IPTG ve X-Gal nedir? Neden kullanılır?

Agarlı besiyere eklenen X-Gal kromojenik bir substrattır. β-galatosidaz üretilirse X-gal 5-bromo-4 kloro-indoksil’den 5,5′-dibromo-4,4′-dikloro-indigo adı verilen çözünmez ve kendiliğinden dimerize olan bir mavi pigment üretmek üzere hidrolize edilir. Rekombinant olmayan bakteriler tarafından oluşturulan koloniler bu nedenle mavi renkte görünürken rekombinant olanlar beyaz görünmektedir. Bu beyaz rekombinant koloniler kolaylıkla seçilebilir ve kültüre edilebilir.

IPTG (İzopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid), mavi-beyaz tarama için X-gal ile birlikte kullanılır. IPTG, lacZ geninin ekspresyonunu indükleyen, metabolize edilemeyen bir galaktoz analoğudur. IPTG’nin β-galatosidaz için bir substrat olmadığı, sadece bir indükleyici olduğu unutulmamalıdır. Görsel tarama amacıyla, X-Gal gibi kromojenik substrat gereklidir.