Gen raportör sistemleri, bitki araştırmalarında gen ekspresyon düzenlemesinin incelenmesi için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Bu sistemlerde, genellikle bir enzim olan bir gen raportörü, spesifik bir gen promotörüne eklenerek, gen raportörünün spesifik bir promotörün kontrolü altında transkripsiyonuna yol açar. Daha sonra enzim aktivitesi ölçülebilmekte ve gen ekspresyon seviyelerinin göstergesi olarak kullanılabilmektedir.

Bugün kullanılan pek çok raportör arasında, β-glukuronidaz (GUS) en popüler olanıdır ve kısmen çeşitli koşullarda stabilitesi ve hassas deneylerde kullanılması nedeniyle bitkilerdeki transgenik olayların belirlenmesine yardımcı olmuştur. E. coli β-glukuronidaz, çeşitli β-glukoronidlerin kesilmesini katalize eder. β-glukuronidaz, 68.2 kDa moleküler ağırlığa sahiptir ve bir tetramer olarak işlev görmektedir. Çeşitli koşullarda çok kararlıdır ve en çok β-merkaptoetanol (βME) veya DTT gibi tiyol indirgeme ajanlarının varlığında aktiftir. Ek olarak, herhangi bir fizyolojik pH’da test edilebilir ve pH 5,2 ile 8,0 arasında optimal aktiviteye sahiptir. Orijinal GUS raportör geni, E. coli ve C. elegans‘ta bir gen füzyon markörü olarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, şu anda bitkilerde kimerik gen ekspresyonunu izlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. İlginç bir şekilde, maya, Drosophila, C. elegans, Dictyostelium ve hemen hemen her yüksek bitkide saptanabilir β-glukuronidaz aktivitesi çok azdır veya hiç yoktur. Bununla birlikte Agrobacterium‘da, bazı GUS plazmitleri, bir promotörün yokluğunda bile önemli GUS aktivitesi göstermiştir. Bu nedenle, bu sistemi Agrobacterium aracılı transformasyonlarda kullanmak ve spesifik promotörler tarafından gen ekspresyonunu düzenlemesini doğru bir şekilde ölçmek için, ekspresyon işlemi gerçekleşmeden önce işlenmesi gereken bir intron taşıyan GUS genleri bir laboratuvar tarafından geliştirilmiştir. Böylece bitkilerde Agrobacterium aracılı transfer ve yabancı genlerin ekspresyonunun izlenmesi mümkün olmuştur. Transforme edilmiş organizmalardan alınan dokularda ve hücrelerde β-glukuronidaz aktivitesinin kalitatif bir analizini histokimyasal testlerle ve florimetrik yöntemlerle belirlenebilir.

Bu sistemin CRISPR-Cas9 sisteminde kullanılmasını bir örnek üzerinden inceleyelim. Model organizma olan Arabidopsis’te CRISPR-Cas9 ile hedef genimizde bir mutasyon yapmayı amaçlayalım. Bunun için ilk başta CRISPR-Cas9 sisteminin Arabidopsis’te çalışacağını GUS raportör sistemiyle gösterelim. Bunun için ilk başta bir vektör kaseti tasarlayalım. Bu plazmitte sgRNA olarak GU-US dizisinin içinde yer alan çoklu tanıma bölgesine (MRS: Multiple Recognition Site) spesifik sgRNA dizisini ekleyelim. Bu sgRNA’nın Arabidopsis‘te güçlü bir şekilde eksprese olması için U6 promotörü (pAtU6) ile birleştirelim. Daha sonra Cas9 proteinimizin de güçlü bir şekilde eksprese olması için UBQ promotörüyle (pAtUBQ) birleştirelim. Aynı zamanda Cas9 proteinine çekirdeğe gitmesi için nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) ekleyelim. (NLS asıl deneye geçtiğimizde Cas9 proteinin çekirdeğe gitmesini sağlayacaktır.) Etiket olarak da FLAG eklenebilir. Ekspresyonun sonlanması için termintör bölge (tUBQ) ekleyelim. Oluşturduğumuz ekspreasyon kasetini içinde GUUS raportörü bulunan ikili vektöre (binary vector) aktaralım. Artık vektörümüz hazır (Şekil 1). Bu ikili vektör Arabidopsis‘e aktarıldığında sgRNA ve Cas9 proteinini üretecek.

Şekil 1. CRISPR-Cas9 sisteminde GUS rapotör sistemi.

İkili vektör Agrobacterium ile Arabidopsis’e aktaralım. Vektörümüz eksprese olacak ve sgRNA ve Cas9 proteinini üretecek ve sgRNA-Cas9 kompleksi oluşacak ve hedef bölgeye (MRS) gidip bağlanacaktır (Şekil 1).

Hedef bölgeye (MRS) bağlanınca Cas9 proteini çift zincir kırıkları oluşturacaktır. Hücre çift zincir kırıklarını onarmak için homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) yöntemini veya homolog rekombinasyon (HR) yöntemini seçecektir. Bitkilerde NHEJ daha fazla tercih edilmektedir. Ama GUUS sistemi homolog rekombinasyon gerçekleşecek şekilde tasarlandığı için hücre homolog rekombinasyonuda tercih edecektir (Şekil 2). Ama bu NHEJ hiç gerçekleşmeyecek anlamına gelmez. Şekil 1’de görüldüğü üzere GU-US plazmitinde GU (1-710bp) iken US (155-1862bp) olacak şekilde tasarlanmıştır. Yani birbirlerine homoloji göstermektedirler. Bundan dolayıda hücre çift zincir kırığını tamir ederken bu homolojiden yararlanır (Şekil 1 ve Şekil 2).

Şekil 2. GUUS hedef dizisinde meydana gelen çift zincir kırığının onarılması ve fonksiyonel GUS üretiminin gerçekleşmesi.

HR ile tamamlanan çift zincir kırığı sonucunda GUS enzimi üretmek için olan dizi elde edilir ve başındaki 35S promotörü (p35S) sayesinde GUS enzimi o hücrede üretilir (Şekil 1 ve Şekil 2).

NHEJ ile tamamlanan çift zincir kırığında mutasyonlar meydana gelir ve GUS üretmek için gereken dizi bozulmuş olur. Bu hücrede GUS proteini üretilmez (Şekil 1 ve Şekil 2).

Daha sonra bu enzimin aktivitesi histokimyasal GUS boyaması ile görünür hale getirilir. Ne kadar çok çift zincir kırığı oluşup HR ile tamir edildiyse o kadar çok GUS üretilecektir. Daha sonra bu GUS histokimyasal yöntemle belirlenecektir.

Histokimyasal GUS boyaması

Şu anda, X-Gluc substratı dokularda ve hücrelerde β-glukuronidaz (GUS) aktivitesinin histokimyasal lokalizasyonu için kullanılmaktadır. Bu substrat oldukça etkilidir ve enzim aktivitesi bölgesinde mavi bir çökelti oluşturur. Özellikle, doku hazırlığı ve fiksasyonunun tüm yönleri ve reaksiyonun kendisi dahil, β-glukuronidaz (GUS) histokimyasal lokalizasyonunun kalitesini etkileyen çok sayıda değişken vardır. Bu nedenle, reaksiyonun doğasını anlamak gerekir. X-Gluc’un glukuronidaz hidrolizinin ilk ürününün rengi yoktur. Bunun yerine, üretilen ilk indoksil türevi, çözünmez ve oldukça renkli indigo boyayı oluşturmak için bir oksidatif dimerizasyondan geçmelidir. Bu dimerizasyon, atmosferik oksijen tarafından uyarılır ve bir K+ ferrisiyanür / ferrosiyanür karışımı gibi bir oksidasyon katalizörü kullanılarak geliştirilebilir. Katalizör olmadan sonuçlar genellikle çok iyidir, ancak lokalize peroksidazların glukuronidazın görünen lokalizasyonunu artırabileceği olasılığı göz önünde bulundurulmalıdır. Ek olarak, fiksasyon koşulları doku tipine ve fiksatifin geçirgenliğine göre değişecektir. Örneğin, glutaraldehit kullanılıyorsa, yaprak kütikülüne kolayca nüfuz etmediği ancak gövde enine kesitlerine iyi nüfuz ettiği unutulmamalıdır. Alternatif olarak, formaldehit, glutaraldehitten daha iyi bir fiksatif gibi görünmektedir ve daha uzun süre kullanılabilir. Ayrıca kallus, süspansiyon kültür hücreleri ve protoplastlar gibi tüm dokular, bütün bitkiler veya bitki organları boyanabilir. Boyamadan sonra, doku %70 etanol ile temizlenerek kontrastı biraz daha iyileştirilebilir.

Yöntem:

1. CRISPR-Cas9 uygulaması yapılmış olan bitkiden bir veya iki taze yaprak alınır ve dörde bölünür.
2. Parçalar 24 kucuklu plakalarda 0.5 ml X-Gluc boyasına aktarılır. En az 1 saat en fazla gece boyu 37 °C’de inkübe edilir.
3. Boyamadan sonra yaprak parçaları % 70 Etanol içinde en az 5 dakika durulanır.

Not: Yeşil renk devam ederse, klorofil dokusu en az 4 saat % 70 Etanolde yıkanarak temizlenir.

1. Diseksiyon mikroskobu altında GUS boyaması incelenir
2. Örnekler çeker ocakta oda sıcaklığında 3 aya kadar (veya çökeltiler görünene kadar) saklanabilir.

Şekil 3. GUS boyması yapılmış Arabidopsis dokuları

Şekil 4. GUS boyması yapılmış Arabidopsis dokuları

Boyama olduysa CRISPR-Cas9 sisteminin başarılı bir şekilde çalıştığı , promotörlerin Arabidopsis‘te genleri eksprese ettiği söylenebilir ve böylece GUS raportör sistemi kullanma amacına ulaşılmış olunur. Promotölerin çalıştığı ve CRISPR sisteminin çalıştığı belirlendiğine göre bir sonraki basamak gerçek hedef gen için gRNA belirleyip CRISPR ile hedeflemektir. Bu sistem sadece Arabidopsis için değil diğer organizmalar içinde kullanılabilir. Vektörlerde o organizma için optimize edilmelidir.

β-glukuronidazlar için subsrat olarak farklı glukuronidler kullanılabilir. Farklı glukuronidlerden hangisinin kullanılacağı analiz yöntemine (histokimyasal, spektrofotometrik ve florimetrik) göre belirlenir. Yukarıda da bahsettiğimiz gibi GUS histokimyasal boyaması için en yaygın kullanılılan substrat X-Gluc (5-bromo-4-kloro-3-indolil glukuronid)’dir. Bu substratta oluşan ürün mavi renklidir. Diğer yaygın kullanılan substratlar ise spektrofotometrik analizler için p-nitrofenil β-D-glukuronid ve florimetrik analizler için 4-metilumbelliferil-beta-D-glukuronid (MUG) yaygın bir biçimde tercih edilir. Bir organizmanın GUS testine uygun olması için hiç veya çok az miktarda β-glukuronidaz aktivitesi içermesi gerekir. Bundan dolayı omurgalılar ve  yumuşakçalar bu analize uygun değillerdir. Fakat tohumlu bitkiler, yosunlar, algler, eğreltiler, mantarlar ve birçok bakteri tanımlanan GUS aktivitesi içermediklerinden bu canlılar da GUS analizi yapılabilir. GUS raportör sistemi bu nedenle bitki çalışmalarında yaygın olarak kullanılan bir sistemdir.

GUS analizi ve diğer raportör gen sistemleri, klasik promoter aktivite analizi dışındaki diğer türdeki çalışmalar için kullanılabilir. Raportör sistemler, gen dağıtım sistemlerinin etkinliğinin belirlenmesi, bir gen ürününün hücre içi lokalizasyonu, protein-protein veya protein-DNA etkileşimlerinin tespiti, translasyon başlatma sinyallerinin etkinliği ve moleküler klonlama çalışmalarının başarısı için kullanılmıştır.

Kaynaklar:

• Mao Y, Zhang H, Xu N, Zhang B, Gou F, Zhu JK. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Mol Plant. 2013;6(6):2008-2011. doi:10.1093/mp/sst121
• Rozwadowski, K., Yang, W. & Kagale, S. Homologous recombination-mediated cloning and manipulation of genomic DNA regions using Gateway and recombineering systems. BMC Biotechnol 8, 88 (2008). https://doi.org/10.1186/1472-6750-8-88
• Feng Z, Mao Y, Xu N, et al. Multigeneration analysis reveals the inheritance, specificity, and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(12):4632-4637. doi:10.1073/pnas.1400822111
• GUS