Gen splayzı, tek bir genin birden fazla proteini kodlayabildiği transkripsiyon sonrası bir modifikasyondur. Gen splayzı, ökaryotlarda, mRNA translasyonundan önce, öncü haberci RNA (pre-mRNA) bölgelerinin farklı şekillerde eklenmesi veya çıkarılmasıyla gerçekleşir. Gen splayzı, protein çeşitliliğinin önemli bir kaynağıdır. Tipik bir gen splayzı işlemi sırasında, bir genden kopyalanan pre-mRNA, çok sayıda fonksiyonel protein üreten farklı olgun mRNA moleküllerinin oluşmasını sağlayabilir. Bu nedenle, gen splayzı, yapısal ve işlevsel olarak farklı protein izoformlarının sentezine izin vererek tek bir genin kodlama kapasitesinin artırılmasını sağlar. Genlerin bölünmesi, çoğu gende yüksek oranda genlerde gözlenir. İnsan hücrelerinde, genlerin yaklaşık %40-60’ının alternatif splayz sergilediği bilinmektedir.

Gen Splayz Mekanizmaları

Birkaç tür ortak gen splayz olayı vardır. Bunlar, moleküler biyolojinin santral dogmasının transkripsiyon aşamasından mRNA oluşturulduktan sonra genlerde eş zamanlı olarak meydana gelebilen olaylardır.

Ekzon Atlama (Exon Skipping):

Bu, ekzon veya ekzonların, uzatılmış veya kısaltılmış mRNA varyantlarına yol açan nihai gen transkriptine dahil edildiği veya hariç tutulduğu bilinen en yaygın gen splayz mekanizmasıdır. Ekzonlar, bir genin kodlama bölgeleridir ve çeşitli hücre tiplerinde bir dizi işlev için kullanılan proteinlerin üretilmesinden sorumludur (Şekil 1).

İntron Tutma (Intron Retention):

Son transkriptte bir intronun tutulduğu bir olay. İnsanlarda genlerin %2-5’inin intron tuttuğu bildirilmiştir. Gen ekleme mekanizması, genin kodlamayan (gereksiz) kısımlarını tutar ve protein yapısında bir demorniteye ve işlevselliğe yol açar (Şekil 1).

Alternatif 3′ Splazy Bölgesi ve 5′ Splazy Bölgesi:

Alternatif gen splayzı, farklı 5′ ve 3′ splayz bölgesinin birleştirilmesini içerir. Bu tür gen birleştirmede, iki veya daha fazla alternatif 5′ splayz bölgesi, iki veya daha fazla alternatif 3′ splayz bölgesine katılmak için rekabet eder (Şekil 1).

Şekil 1. Alternatif splazy mekanizmaları

Ökaryotik hücreler, gen ekspresyonunu düzenlemek için çok çeşitli transkripsiyon sonrası mekanizmalar kullanır. Bu süreçler arasında pre-mRNA splayzı, hücrelerdeki proteom karmaşıklığını artırmak için önemli bir işlev oynar. pre-mRNA splayzı, olgun bir mRNA molekülü oluşturmak için intronların uzaklaştırıldığı, transesterifikasyon olarak bilinen kimyasal bir reaksiyonla gerçekleşir. İnsanlarda, genlerin yaklaşık %95’i, farklı ekzon kombinasyonlarına sahip transkriptler üretmek için alternatif splayz işleminden geçer. Splaysozomal proteinlerde somatik mutasyonların ortaya çıkması veya RNA bağlayıcı protein (RBP) ekleme faktörlerinin düzensiz ekspresyonu, yanlış splayz olmuş mRNA transkriptlerinin oluşmasına katkıda bulunur ve bu da kanser büyümesini destekler.

Genel RNA splayz mekanizması, iki aşamalı bir transesterifikasyon reaksiyonunda meydana gelir. İlk aşamada dallanma noktası (branch point (Şekil 2)) dizisindeki bir 2′-hidroksil grubu tarafından 5′ splayz bölgesinde (aynı zamanda splayz donörü olarak da bilinir) nükleofilik bir saldırı ile başlar. Bu ilk reaksiyon, iki uç uca splayz ara ürünü oluşturur, bu ara ürün kesilmiş bir 5′ ekson, intron ve 3′ ekson içeren bir lariant (kement) yapı içermektedir (Şekil 3).

Şekil 2. pre-mRNA ve splayz bölgeleri şematik gösterimi. İntron-ekzon bağlantı bölgeleri splayz reaksiyonunun gerçekleştiği noktalardır. Bu bağlantı bölgeleerinde bulunan diziler türler arasında ve genlerde aynıdır. Herbir intron iki uçtan kesilier ve 5′ uç her zaman GU, 3′ uş her zaman AG taşır. Buna GU-AG kuralı denir. Diğer değişmez bölge 3’ splays bölgeden nt önde bulunan A nükleotididir. Bu birim ara bir reaksiyonda görev alır ve intronun kesilmesi için gereklidir.

İkici aşamada, ayrılmış 5′ ekzon üzerindeki 2′-hidroksil grubu, intronun 3′ splayz alanına (aynı zamanda splayz alıcısı olarak da adlandırılır) saldırarak, fonksiyonel olgun mRNA üretmek için intronun çıkarılmasına ve ekzonların ligasyonuna yol açar (Şekil 3,4,5).

Şekil 3. Splayz mekanizması. Splaysozomda bulunan snRNA’lar korunmuş intron dizileriyle Hidrojen bağı kurarak splayz bölgeleri karşılıklı olarak gelir. Sonraki aşama splaysozomun reaksiyonu katalizyerek intronları uzaklaştırmasıdır.

Şekil 4. Splayz mekanizması birinci transesterfikasyon

Şekil 5. Splayz mekanizması ikinci transesterfikasyon

RNA splayzı, splaysozom, cis-etkili ve trans-etkili proteinler gerektiren oldukça düzenlenmiş bir süreçtir. Splaysozom, pre-mRNA splayz sırasında bileşimini ve yapısını dinamik olarak değiştiren büyük bir multimerik ribonükleo-protein (RNP) kompleksidir. Splaysozom, beş ana küçük nükleer ribonükleoprotein (snRNP’ler), U1, U2, U4/U6 ve U5’ten oluşur ve aynı kökenli küçük nükleer RNA (snRNA) ile ilişkilendirilir. Ayrıca, RNA düzenleyici dizilerin varlığı, transkripsiyon sonrası düzenlemede önemli bir rol oynar. Gen splayzında, ekzonik/intronik ekleme arttırıcılar (ESE’ler/ISE’ler) ve susturucular, 5′ ve 3′ bağlantı bölgeleri, dallanma noktası (branch point) sekansı gibi cis-etkili sekanslar ve polipirimidin yolu, splaysozom ve splaysozomal ilişkili faktörlerin toplanması için önemlidir. Bugüne kadar, kütle spektrometrisi insan splaysozom kompleksiyle etkileşime giren 200’den fazla yardımcı protein faktörü tanımlamıştır. Klasik trans-etkili splayz proteinleri, heterojen nükleer ribonükleoproteinler (hnRNP’ler) ve serin/arginin açısından zengin (SR) proteinlerdir ve sırasıyla splays edici susturuculara (silencer) ve güçlendiricilere (enhancer) tercihen bağlanır. SR proteinleri, diğer splayz faktörleri arasındaki protein-protein etkileşimlerine aracılık ettiği öne sürülen, özellikle serin açısından zengin (RS: serine-rich) bir alan ile karakterize edilen RBP’lerdir. Ayrıca, SR proteinleri, ek splaysozomal faktörleri devreye sokmak için pre-mRNA üzerindeki ESE ve ISE’lere bağlanan bir veya daha fazla RNA tanıma motifi (RRM: RNA-recognition motifs) içerir. Bununla birlikte, hnRNP’lerin genellikle alternatif splayz sırasında SR proteinlerini antagonize ettiği bilinmektedir. Dahası, hnRNP ailesi üyeleri genellikle RNA bağlama alanı (RBD: RNA binding domain) bileşimlerinde (örneğin RRM, KH ve RGG alanları) daha çeşitlidir ve tercihen splayz susturucularla etkileşime girer. Özetle, cis-etkili öğeler ve trans-etkili proteinler arasındaki etkileşim, splayz düzenlemesi için gereklidir.

Şekil 6. Alternatif splayz mekanizmaları

Alternatif splayz farklı mRNAlar üretir sonuçta da aynı transkriptten farklı proteinler oluşur. Aynı proteinin alternatif formları bu mekanizmayla oluşur ve farklı hücre tiplerinde kullanılır ya da gelişimin erken dönemlerinde farklı aşamalarda bu proteinlere rastlanır. Gelişim sürecinde alternatif splayz çok önemlidir.

pre-mRNA splayzı, translasyondan sonra gerçekleşir ve tek bir gen tarafından kodlanan bir proteinin farklı izoformlarının eksprese edilmesiyle sonuçlanır. Alternatif splayz, genlerin sayısını artırmadan daha fazla protein çeşitliliğinin üretilmesine izin verir. Alternatif splayz, farklı ekzon kombinasyonlarını dahil ederek ve hariç tutarak bu farklı izoformları üretir ve farklı olgun mRNA molekülleri ile sonuçlanır (Şekil 7). Elde edilen protein izoformları ilişkili, farklı veya hatta zıt biyolojik özelliklere sahip olabilir. Sıkı düzenlenmiş alternatif splayz süreci, hücreye hücre içi ve hücre dışı uyaranlara hızla uyum sağlama yeteneği sağlar. Alternatif splayz, tüm insan genlerinin büyük çoğunluğunda meydana gelir ve gen başına ortalama altı protein izoformu ile sonuçlanır. İnsan genomunun tahmini 22.000 protein kodlama geninin >200.000 gözlemlenen protein izoformuna neden olmasının nedeni budur. Bir organizmada alternatif splayzın yaygınlığı, doğrudan o organizmanın karmaşıklığıyla ilgilidir. Bu, alternatif splayzın neredeyse tüm biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynayacak şekilde geliştiğini gösterir. Bu biyolojik süreçlerin normal ilerlemesi için alternatif splayzın uygun şekilde düzenlenmesi gerekir. Anormal alternatif splayz hastalıkla ilişkilidir.

Şekil 7. LepR-mRNA’sının alternatif splayzı. Leptin reseptör ekleme varyantlarını temsil eden şematik şekil. Lep-r splayz varyantları, farklı izoformları göstermektedir. Ekzonlar numaralandırılmış kutularla gösterilmiştir.



Gen splayzı, insan fizyolojisi ve hastalığında önemli bir rol oynayan alternatif proteinlerin sentezine yol açar. Şu anda, splayz varyantlarının büyük ölçekli tespiti için en verimli yöntemler, hesaplamalı tahmin yöntemlerini ve mikro dizi analizini içerir. Mikroarray tabanlı splayz varyantı algılama, şu anda kullanımda olan en popüler yöntemdir. Mikroarray yöntemi oldukça tutarlı ve hassas doğası, dokuya özgü ve genomun geniş bir seviyede gen ekspresyonunu izlemek için idealdir. Splayz varyantlarını tespit etmek için mikroarray tabanlı yöntemler, alternatif gen splayzının yüksek verimli keşfi için sağlam, ölçeklenebilir bir platform sağlar. Yeni gen izoformlarının keşfedilmesi için yaygın olarak kullanılan bir başka yöntem, RT-PCR ve ardından dizilemedir. Bu güçlü bir yaklaşımdır ve az sayıda geni analiz etmek için etkili bir şekilde kullanılabilir.

Kaynaklar:

• Wang E, Aifantis I,. RNA Splicing and Cancer, Trends in Cancer, August 2020, Vol. 6, No. 8, Pages 631-644, https://doi.org/10.1016/j.trecan.2020.04.011
• Dlamini Z, Hull R, Makhafola TJ, Mbele M. Regulation of alternative splicing in obesity-induced hypertension. Diabetes Metab Syndr Obes. 2019;12:1597-1615. Published 2019 Aug 28. doi:10.2147/DMSO.S188680
• Gen splayz-2