Bilim insanı @Bilim_insani_835

Sınıf 1 Tip I-E ve Tip I-F CRISPR-Cas Sistemi

CRISPR-Cas sistemleri güçlü genom düzenleme araçları olarak ortaya çıkmıştır. Ökaryotik genom düzenleme mühendisliğinde şimdiye kadar en çok kullanılan CRISPR sistemleri Sınıf II Tip II-Cas9 ve Sınıf II Tip V-Cas12’dir ve bu sistemler ökaryotik genom düzenleme araçları olarak benimsenmiştir.


Bunun aksine en fazla çeşit Sınıf I (yedi alt tip, I–A ila I–G) CRISPR sisteminde bulunmaktadır. Tip I ve III olarak tanımlanan Sınıf I CRISPR sistemi, çoklu alt birim efektör kompleksi kodlar. Tip I’de, 3-5 proteinden (alt tipine bağlı olarak değişir) oluşan, antiviral savunma için CRISPR ile ilişkili bir kompleks (Cascade: CRISPR associated complex for antiviral defense), RNA güdümlü DNA hedefini tanımayı kolaylaştırır. Hedef ile kompleks hale geldikten sonra, hedef DNA yıkımını gerçekleştirmek için Cascade kompleksi için Cas3 aktive edilir. Cas9 ve Cas12 proteinlerine benzer şekilde, tip I Cascade doğal ortamında bir PAM dizisini tanır. Tip I-E sistemlerinde, Cascade tarafından PAM tanıma, CasA proteini tarafından gerçekleştirilir ve tipik olarak protospacerın yukarısında (upstream) bulunan 1-3 nükleotitten olur. Cascade’nin kılavuz RNA’sı (gRNA) tek bir CRISPR RNA’dır (crRNA) (Şekil 1).


Genom düzenleme uygulamaları için Cascade sistemi diğer tekli efektörlere göre (Cas9, Cas12 vb.) bazı avantajlar sağlamaktadır. İlk olarak, Cascade’in bir bileşeni olan CasE, doğal kılavuz RNA işlemeyi sağlayan bir ribonükleazdır. Bu, birçok kılavuz RNA’nın tek bir promotörden birlikte transkripsiyonunu ve birçok polimeraz II promoteri gibi tanımlanmış bir transkripsiyonel başlangıç bölgesi olmayan promotörlerin kullanılmasını sağlar. Bazı Cas12 efektörleri bu kabiliyeti geliştirmiş olsa da, Cas9’da yoktur.


İkinci olarak, Cascade crRNA’da hedef tanıma tipik olarak ~30 bp veya daha büyük bir alanı kapsar bu da daha büyük ve daha karmaşık ökaryotik genomlarda yüksek özgüllük potansiyeli sunar.


Daha sonra, tip I sistemleriyle ilişkili Cas3, Cascade DNA hedeflerine büyük kromozomal delesyonların oluşması için yeni bir yaklaşım sunar.


Son olarak, 8-11 proteinden oluşan Cascade, Cas proteinlerine yeni domainlerin eklenmesi ve oluşturulması (VPR, VP64, p300, KRAB vb.) için birden fazla yapısal seçenek sunar.

tip I-E CRISPR-Cas  <p><strong style="color: rgb(0, 0, 0);">&nbsp;tip I-E CRISPR-Cas</strong></p>

Şekil 1. S. thermophilus DGCC7710’un doğal tip I-E CRISPR-Cas lokusu. CRISPR tekrarları siyah bir elmas ile gösterilmiştir ve aralayıcı bölge (sapacer) mavi renktedir. CasE, tasvir edilen olgun crRNA’yı oluşturmak için birincil CRISPR RNA (pre-crRNA) transkriptini ayırır. 5′ PAM bölgesindeki crRNA tarafından yönlendirilen Cascade kompleksi, gösterildiği gibi çift sarmallı bir DNA hedefini tanır.


Yapılan çalışmalarda tip I–B ve I–E sistemleri memeli gen ekspresyonunu kontrol etmek ve genom düzenleme için kullanılmıştır.


tip I-F CRISPR-Cas   <p><strong style="color: rgb(0, 0, 0);">&nbsp;tip I-F CRISPR-Cas&nbsp;</strong

Şekil 2. Pseudomonas aeruginosa type‘un doğal tip I-F CRISPR-Cas lokusu. 5′-CC-3 ′ PAM tanıma ve DNA hedef bölgesinde baz eşleştirme ile işlenmiş crRNA’nın şematik temsili.


Sınıf 1 ve sınıf 2 CRISPR–Cas sistemi arasındaki farklar, bazı uygulamalarda Sınıf 1 CRISPR–Cas sisteminin avantajlarına katkıda bulunabilir. Son sınıflandırma çalışmalarına göre, tip I CRISPR–Cas sisteminde yedi alt tip (I–A ila I–G) vardır.


Son yıllarda, tip I–A, I–B, I–E ve I–F CRISPR–Cas sistemleri Sulfolobus islandicus (I–A), Clostridium pasteurianum (I–B), Lactobacillus crispatus (I–E), Zymomonas mobilis (I–F) ve Pseudomonas aeruginosa (I–F) prokaryotik gen mühendisliği için kullanılmıştır.


Chen ve ekibi yaptıkları çalışmada Sınıf 1 Tip 1-F CRISPR sistemini kullanarak memeli hücrelerinde (HEK293T) endojenik HBB, HBG1/2, SOX2, OCT4, IL1B, ve IL1R2 genlerinin aktivasyonunu başarıyla gerçekleştirmişlerdir. Aynı çalışmada crRNA uzunluğu değiştirilerek sistemin başarısı arttırılmıştır.


Young ve ekibi de yaptıkları çalışmada Sınıf 1 Tip 1-E CRISPR sistemini kullanarak Zea mays (mısır)’da gen aktivasyonunu gerçekleştirmişlerdir. Sınıf 1 CRISPR sistemleri genom düzenlemede ne kadar başarılı olduğunu yapılan çalışmalarla göstermektedir. İlerleyen zamanlarda sistemin detaylı çalışılmasıyla beraber bir çok alanda kullanılmaya başlanacaktır.


Genom mühendisliğinde kullanılacak CRISPR sistemi (Sınıf 1 veya Sınıf 2) araştırmacının amacına göre belirlenmelidir. Her sistemin kendine göre avantajları bulunmaktadır. Çalışmayı yapacak araştırmacı bu avantajlara göre kendi çalışması için en uygun sistemi bulup deneyini ona göre tasarlamalıdır.


Kaynakça:

  • Chen, Y., Liu, J., Zhi, S. et al. Repurposing type I–F CRISPR–Cas system as a transcriptional activation tool in human cells. Nat Commun 11, 3136 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-16880-8
  • Young, J.K., Gasior, S.L., Jones, S. et al. The repurposing of type I-E CRISPR-Cascade for gene activation in plants. Commun Biol 2, 383 (2019). https://doi.org/10.1038/s42003-019-0637-6


3

Henüz hiç yorum yapılmamış.

Yorum yazmak için giriş yapmanız gerekli