CRISPR ile baz düzenleme, yeni bir yöntem olarak geliştirildi; ancak şu ana kadar C>T ve A>G dönüşümleriyle sınırlı kaldı. Son zamanlarda, belirli bir DNA bölgesine doğrudan yeni genetik bilgi yazabilen çığır açıcı bir genom editörü olan “birincil düzenleme (PE: prime editing)”, genom düzenlenmesinin kapsamını ve yeteneklerini büyük ölçüde genişletmiştir.

PE sisteminde, Cas9 proteini, bir ters transkriptaz (RT: Reverse Transcriptase) enzimi ile kaynaşmış olarak tasarlanır ve sgRNA’nın yerine birincil düzenleme kılavuz RNA (pegRNA: prime editing guide RNA) kullanılır. Bu pegRNA hedef tanıma bölgesi ve hedef genom içine eklenecek DNA dizisini içeren bir RNA şablonudur (Şekil 1). PE, DNA kırılmalarına veya verici DNA şablonlarına ihtiyaç duymadan insan hücrelerinde hedeflenen eklemeleri, silmeleri ve 12 tip nokta mutasyonunu (C>T, G>A, T>C ve A>G) gerçekleştirebilir.

Şekil 1. Prime editing bileşenleri

Şu anda üç ana editör sistemi geliştirilmiştir. Bunlar:

• PE1, geliştirilen ilk PE sürümüdür. Bu sistemle ekleme, silme işlemleri ve baz transversiyonları başarıyla gösterilmiştir.
• PE2, düzenleme verimliliğini artırma çalışmalarında oluşturulmuştur. Daha iyi bağlanma ve termostabilizasyon göstermiştir.
• PE3 ve PE3b, en yeni sürümdür, PE ile oluşan uyumsuzluk dizilerini düzeltme yeteneğine sahiptir.

pegRNA, CRISPR gen düzenlemesi için yaygın olarak kullanılan standart sgRNA’lardan (>100nt ve 20nt) büyük ölçüde daha büyüktür. pegRNA, bir primer bağlanma sekansına (PBS) ve 3′ ucuna ilave edilen istenilen RNA sekansını içeren şablona sahip bir sgRNA’dır. Şu anda, pegRNA’lar plazmidler ve in vitro transkripsiyon kullanılarak oluşturulur. Birlikte, hücre içindeki genom düzenlemesine aracılık etmek için kullanılan PE: pegRNA kompleksini oluştururlar.

Genel hatlarıyla aşama aşama işlemler şu şekilde gerçekleşir:

1. Deney tasarlanırken pegRNA oluşturulur. pegRNA içerisinde eklemek istenilen dizi bilgisi de bulunur. nCas9 (H840A) enzimine RT eklenir.
2. nCas9 (H840A) PAM dizisinin olduğu diziyi keser. pegRNA çıkıntı yapan DNA dizisiyle hibridize olur. PE: pegRNA kompleksi, hedef DNA’ya bağlanır ve Cas9, bir çıkıntı oluşturarak sadece bir ipi çeker.
3. pegRNA üzerinde bulunan primer bağlanma bölgesi (PBS: primer binding site), DNA çıkıntısına bağlanır ve düzenlenen RNA sekansı (hedeflenen dizi), ters transkriptaz kullanılarak ters transkripsiyonu yapılır. RT, istenen düzenlemenin transkripsiyonunu şablonlamak için pegRNA’yı DNA dizisine çevirerek kullanır ve DNA’yı doğrudan çentikli hedef DNA zinciri üzerine polimerize eder.
4. Düzenlenen iplik, çıkıntının sonunda DNA’ya dahil edilir ve hedef DNA, yeni ters kopyalanmış DNA ile onarılır. Orijinal DNA segmenti bir hücresel endonükleaz tarafından çıkarılır. Bunun sonucunda bir iplik düzenlenmiş ve bir iplik düzenlenmemiş olarak kalır (Şekil 2).

Şekil 2. CRISPR–Cas9 aracılı ana düzenleme. nCas9 (H840A), bir H840A mutasyonuna sahip olan ve sadece PAM sekansı ile DNA zincirini parçalayabilen bir Cas9 nikazdır. nCas9-RT kompleksi, hedeflenen genom içine yeni DNA dizileri oluşturacaktır.

En yeni PE sisteminde (PE3 ve PE3b), düzenlenmemiş iplik, ilave bir standart kılavuz RNA kullanılarak yeni düzenlenmiş iplik ile eşleşecek şekilde düzeltilebilir. Bu durumda, düzenlenmemiş iplikçik bir Cas9 nikaz tarafından kesilir ve yeni düzenlenen iplikçik tamir etmek için bir şablon olarak kullanılır, böylece düzenlemeyi tamamlar (Şekil 3).

Şekil 3. PE sistemlerinin düzenlemedeki son basamakları arasındaki fark

Kaynakça:

• Zhang, Y., Pribil, M., Palmgren, M. et al. A CRISPR way for accelerating improvement of food crops. Nat Food 1, 200–205 (2020). https://doi.org/10.1038/s43016-020-0051-8
• Prime editing