Genetik biliminin gelişmesi ve buna bağlı olarak DNA teknolojisindeki ilerlemeler, bitki genetiği ve ıslahında kullanılan ve genetik markör olarak isimlendirilen markörlerin gelişmesini ve çeşitlenmesini sağlamıştır. Farklı tipte DNA moleküler markör sistemlerinin geliştirilmesi ve buna bağlı olarak bitki genomlarının amaca göre bu DNA markörleri ile işaretlenmesi ve yeni nesil sekanslama yöntemlerinin gelişmesi, bitki ıslahı sürecini hızlandırmıştır. Moleküler ıslah, bitkiler üzerinde çalışılan karakterleri (bitki boyu, hastalıklara dayanıklılık vb.) ıslah etmek için ”Genetik Mühendisliği”, ”Marköre Dayalı Seleksiyon” ve ”Geneomik Seleksiyon” gibi DNA düzeyinde genetik manipülasyona olanak sağlayan tekniklerin kullanılması olarak tanımlanabilir. Bitki ıslahında, geçmişten günümüze, yaygın olarak kullanılan 2 tip genetik markör vardır. Bunlar; klasik genetik markörler ve moleküler DNA markörleridir (Şekil 1).

Şekil 1. Bitki ıslahında kullanılan genetik markörler

1. KLASİK GENETİK MARKÖRLER

1.1. Morfolojik Markörler

Morfolojik markörler, herhangi bir popülasyonda amaca uygun bitkilerin seçilmesi için bitki ıslahının erken dönemlerinde yoğun olarak kullanılmıştır. Örneğin; yaprak şekli, çiçek rengi, tüy rengi, bakla rengi, tohum rengi, tohum şekli, meyve şekli, kabuk rengi, meyve et rengi ve sap uzunluğu gibi. Bitki ıslahında kullanılan morfolojik markörler genellikle kolay tanımlanabilen, çevre şartlarından etkilenmeyen ve kalıtımı basit olan karakterleri temsil etmektedir. Bitki ıslahında kullanılan morfolojik markörlerin bazıları, önemli tarımsal özellikler ile ilişkili olduğundan pratik ıslah çalışmalarından seleksiyon kriteri olarak kullanılmıştır, amaca uygun olabileceği düşünülen bitkiler erken dönemde morfolojik markörler yardımıyla seçilebilir.

Bitki ıslahında kullanılabilen morfolojik markör sayısı hem oldukça sınırlı hemde morfolojik markörlerin polimorfizm oranı oldukça düşüktür. Aynı zamanda bu markörlerin çoğunluğu verim ve kalite gibi ekonomik öneme sahip özellikler ile ilişkili olmadıkları gibi, bitkinin büyümesi gibi ve gelişmesi üzerinde arzu edilmeyen etkilere sahiptirler. Bundan dolayı da bu markörlerin bitki ıslahında yoğun kullanımı birkaç morfolojik markör dışında sınırlı kalmıştır.

1.2. Sitolojik Markörler

Bitkilerin sahip oldukları kromozom sayısı, poliploidi seviyesi, kromozomların boyutları vb. sitolojik markörlerdir. Bu markörler bitki sınıflandırması ve taksonomi çalışmalarında uzun yıllar boyunca kullanılmıştır. Bu tür markörler özellikle bağlantı gruplarının tanımlanmasında ve fiziksel haritlamada halen kullanılmaktadır.

1.3. Biyokimyasal Markörler

Bitki ısalahında enzimler ve proteinler biyokimyasal markör olarak kullanılmışlardır. Örnek olarak tahıl ıslahında depo proteinlerinin kullanılması verilebilir. Biyokimyasal markörler geçmiş yıllarda bitki türlerinde genetik çeşitliliğin, popülasyon yapısının ve gen akışının saptanmasında başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Fakat kullanılabilecek markör sayısının az ve polimorfizm seviyesinin düşük olması, ekstraksiyon metotlarının zorlukları, bitki dokuları ve farklı büyüme evrelerinden etkilenmeleri bu markörlerin kullanımını sınırlandırmıştır.

2. MOLEKÜLER MARKÖRLER

DNA moleküler markörleri, kısaca bitki genomunda kodlanan veya kodlanmayan bölgelerle ilişkili DNA parçası olarak tanımlanabilir. Başka bir ifadeyle DNA moleküler markörleri, nükleotid dizileridir ve farklı genotiplerin nükleotid dizileri arasında mevcut olan faklılığın (polimorfizm) bulunmasına yardımcı olur. Bitki genomunda görülen kromozma parça eklenmesi (insertion), parça kaybolması (deletion), nokta mutasyonları, parça duplikasyonu ve parça değişimi (translokasyon) bu polimorfizmlerin temelidir.

DNA moleküler markörleri kullanılarak birbirine morfolojik olarak çok yakın olan kültür çeşitleri birbirlerinden rahatlıkla ayırt edilebilir. DNA moleküler markörleri, teorik olarak sınırsız sayıda kabul edilmekte, morfolojik ve biyokimyasal markörlerin aksine çevresel faktörlerden ve bitki gelişim evrelerinden etkilenmemektedirler. Bu markörler kodominant ya da dominant özellikte olu, basit kalıtım ilkelerine sahiptirler.

DNA moleküler markörlerinin herhangi bir bitki ıslahı programında kullanılabilmesi için belli kriterlere sahip olması gerekmektedir. Bunlar;

1. Yeterli düzeyde polimorfizm seviyesine sahip olması
2. Üzerinde çalışılan bitkinin genomunu yeterli düzeyde temsil etmesi
3. Analizlerinin maliyetinin düşük olması
4. Elde edilen sonuçların tekrarlanabilir olması
5. Kısa zamanda çok fazla analizin yapılabilir olması başka bir ifadeyle otomasyona uygun olması gerekmektedir.

Moleküler Markörlerin Sınıflandırılması

DNA markörleri 3 ana grupta incelenmektedir. Bunlar;

• Gen etkisini belirleyen faktörler
• Hibridizasyona veya PCR’ dayalı markörler
• Geçiş şekli (baba organeline dayalı kalıtım, ana organeline dayalı kalıtım, her iki ebeveyn çekirdeğine dayalı kalıtım veya ana çekirdeğine dayalı kalıtım)

2.1. Hibridizasyona Dayalı Markörler

2.1.1. Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism)

Hücrelerden izole edilen genomik DNA’nın restriksyon enzimleri kullanılarak DNA’nın farklı uzunlukta parçalara ayrılması, elde edilen ürünün agaroz jelde yürütülmesi, agaroz jelde yürüyen kesilmiş DNA parçalarının naylon mebrana aktarılması, daha sonra bu naylon membranın radyoaktif (P33) ile işaretlenmiş prob DNA ile melezlenmesi ve bunun X-ray film üzerine aktarılarak görüntüsünün alınması prensibinde dayanmaktadır.

RFLP, ilk DNA markör tekniğidir ve aynı zamanda hibridizasyona dayanan tek markör sistemidir. Bu markör ko-dominant bir markör olup hem anneden gelen hem babadan gelen allellerin tanımlanmasına yardımcı olur. Bu yöntem sayesinde delesyonlar, mutasyonlar, inversiyonlar, translokasyonlar vb. değişimler tanımlanabilmektedir.

RFLP tekniğinin tekrarlanabilirliğinin yüksek olması ve ko-dominant bir markör olması olumlu yönlerini oluşturur. Analizlerin pahalı ve fazla zaman alması, çok iş gücü gerektirmesi, yüksek kalitede DNA’ya ihtiyaç duyulması olumsuz yönlerini oluşturmaktadır. PCR temelli tekniklerin sağladığı avantajlar nedeniyle bu tekniğin kullanımı özel çalışmalarla sınırlı kalmıştır.

2.2. PCR’a Dayalı Markörler

2.2.1. Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA)

Yöntemin temel prensibi, herhangi bir bitki türüne ait genmik DNA üzerinde, uzunluğu 9-10 nükleotid olan ve rastgele seçilmiş primerin, düşük bağlanma sıcaklığında tesadüfi olarak genomik DNA üzerine bağlanarak PCR ile çoğaltma yapılmasına dayanır. Bu çoğaltılmış DNA parçaları tamamen hedef genomun ve primerin hem uzunluğuna hemde büyüklüğüne bağlıdır. Elde edilen PCR ürünü agaroz jel elektroforezinde yürütülür, agaroz jel etidyum bromide ya da gümüş nitrat boyaması ile boyanır ve sonuçlar jel görüntüleme aletinde görüntülenir. Elde edilen sonuçlar, bant durumuna göre var (1) veya yok (0) olarak binary data şeklinde skorlanır ve amaca uygun kullanılır.

Bu yöntem ilk çıktığında çok kullanılmıştır ancak elde edilen sonuçların; DNA miktar ve kalitesi, PCR’da kullanılan kimyasalların içeriği ve oranları ve kullanılan Taq DNA polimeraz enzimine göre değişmesi, diğer bir deyişle sonuçların tekrarlanabilirliğinin düşük olması, bu tekniğin kullanımını kısıtlamıştır.

2.2.2. Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi (AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism)

RAPD ve AFLP tekniklerinin sınırlayıcı etmenlerinden dolayı AFLP yöntemi geliştirilmiştir. AFLP tekniğinin tekrarlanabilirliği ve polimorfizm düzeyi RAPD yöntemine göre oldukça yüksektir. Bu teknikte genomik DNA önce EcoRI enzimi ve MseI enzimi ile kesilir. Kesilen DNA’ların uçlarına her iki enzime de özel olarak tasarlanmış olan adaptörler ligasyon işlemi ile eklenir. Bu adaptörlere spesifik olarak tanımlanan primerler kullanılarak DNA parçacıklarının çoğaltılması sağlanır. PCR aşaması iki aşamada yapılmaktadır. Birinci PCR reaksiyonunda, adaptörleri tanıyan primerlerin uçlarına , ön seçiciliği arttırmak için, bir nükleotid eklenir. Bu PCR aşamasından sonra elde edilen ürünle ikinci PCR yapılır. Bu sefer elde edilen üründe özgünlüğü daha da arttırmak için 2-3 nükleotid eklenir. PCR ürünleri poliakrilamid jelde yürütülür., farklı boyama yöntemleriyle boyanır ve elde edilen sonuçlar var (1) ve yok (0) olarak skorlanır. Bitki genomundan çok sayıda lokusu aynı anda ve etkili bir şekilde analizini yaptığı için DNA parmak izi analizine çok uygundur. Olumsuz yanı ise çok zaman alması ve dominant markör olmasıdır.

2.2.3. Dizi İlişkili Çoğaltılmış Polimorfizm (SRAP: Sequence-Related Amplified Polymorphism)

Teknik olarak açık okuma bölgelerini (ORF: Open Reading Frame) hedef alan PCR temelli dominant bir markör sistemidir. Bu markör sisteminde 18-18 nükleotide sahip primerler kullanılmaktadır. İleri (Forward) primer CCGG dizisine; geri (Reverse) primer ise AATT dizisine sahip olup PCR için ilk 5 döngüde yapışma sıcaklığı 35 ⁰C olarak ayarlanır. Geri kalan 35 döngüde ise yapışma sıcaklığı 50 ⁰C olarak ayarlanır. Elde edilen ürünler agaroz jelde yürütülür, jel boyandıktan sonra görüntülenir.

SRAP PCR ürünleri Li-Cor veya ABI gibi otomatik dizileme sistemlerinde görüntülenebilir ancak primerlerin mutlaka farklı boyalı maddelerle işaretlenmesi gerekmektedir.

SRAP dominant markör sistemidir. SRAP’ın güvenilir ve etkin bir yöntem olmasından dolayı, genetik çeşitlilik çalışmalarında, genetik haritaların oluşturulmasında ve DNA parmak izinin belirlenmesinde yaygın olarak kullanılır.

2.2.4. Basit Tekrarlı Diziler Arası Polimorfizm (ISSR: Inter Simple Sequence Repeat)

Bu teknikte ikili, üçlü, dörtlü ve beşli tekrarlanan nükleotidlere sahip primerler kullanılmakta, bu primerlerle iki mikrosatellit arası bölge çoğaltılabilmekte ve elde edilen PCR ürünleri agaroz jelde yürütülerek atidyum bromür veya farklı boya maddeleri ile boyanmakta ve görüntülenmketedir. Bu teknikte az miktarda DNA ile PCR yapılabilir olması, kullanılacak primer için özel dizi bilgisine gerek olmaması, uygulanmasının çok kolay ve kuruluş maliyetinin çok düşük olması, otomasyona uygunluğu olumlu yönleri olarak ön plana çıkarken, dominant bir markör tekniği olması olumsuzluk olarak nitelenebilir. Bu teknik filogenetik çalışmalar, genetik kaynakların karakterizasyonu, genotipler arasındaki genetik ilişkilerin saptanması ve çeşit tanımlanmaları gibi birçok alanda kullanılmaktadır.

2.2.5. Basit Dizi Tekrarları (SSR: Simple Sequence Repeat)

SSR veya mikrosatellitler, ökaryotik genomlar boyunca sağılmış ve ardışık olarak tekrarlanmakta olan 2-6 nükleotid gruplarından oluşmaktadır. Örnek olarak bu gruplar, (AT)n,(GT)n, (ATT)n, (GACA)n şeklinde gösterilmektedir ve ”n” ardışık tekrar sayısını göstermektedir.

En yaygın SSR dizileri dinükleotid(AC)n, (AG)n, (AT)n, trinükleotid (TCT)n,(TTG)n veya tetranükleoitid (TATG)n yapıdadır. Mikrosatellitler çekirdek DNA’sında, kloroplast ve mitokondri genomunda da bulunmaktadır. SSR tekrarları motif dizisinin genomdaki dizilişine göre 3 farklı gruba ayrılmakta olup bunlar:

• Düzenli tekrar (tek tip motif içeren SSR)
• Birleşmiş tekrar (iki farklı tip motif içeren SSR)
• Düzensiz tekrar (tekrar motifi arasında tek bir baz içeren SSR)’dır.

SSR markörü geliştirmede hem genomik DNA hemde cDNA’dan yaralanılmaktadır. Bu dizi bilgileri incelenerek, SSR motifinin bulunduğu yere komşu bölgelerden (flanking region: korunmuş bölgeler) 18-22 nükleotid uzunluğunda ileri ve geri primerleri tasarlanır. PCR ürünleri, poliakrilamid jelde, yüksek çözünürlüklü agaroz jelde ve kapiler elektroforez cihazlarında yürütülerek sonuçlar elde edilmektedir. SSR markörlerinin, PCR’a dayalı olması, yüksek yapılı bitkilerin genomlarında çok yaygın olarak bulunmaları, polimorfizm seviyesinin yüksek olması, tekrarlanabilmeleri, teknik olarak hızlı, kolay olması ve ko-dominant olmaları tekniğin olumlu yanlarıdır. Ancak bu markörlerin geliştirilmesi için DNA dizi bilgisine ihtiyaç duyulması ve türler arasında aktarılabilirliğinin düşük olması bu yöntemin uygulanmasını sınırlandırmaktadır. SSR markörleri, bitkilerin evrimsel olarak anlaşılmasında , genetik çeşitlilik çalışmalarında, genetik bağlantı haritlarının oluşturulmasında, QTL analizlerinde vb. birçok alanda yoğun olarak kullanılmaktadır.

2.2.5.1. Kloroplast Mikrosatellit (cpSSR: chloroplast Simple Sequence Repeat) Markörleri

Bitki organel genomları (kloroplast ve mitokondri) populasyon genetiği ve bitkilerin evrimi ve filogenetik akrabalık ilişkilerinin ortaya çıkarılmasınsa yaygın olarak kullanılmaktadır. Klorolast genomunda mutasyon frekansı düşük olduğu için belli bölgeleri dizileyerek genetik varyasyonu tanımlamak oldukça zordur. Bunun yerine polimorfizmi yüksek cpSSRmarkörlerinin kullanılması, incelenen genotipler arasındaki genetik varyasyonun hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Özellikle bu durum bu tip markörlerin populasyon genetiğinde yoğun olarak kullanılmasının önünü açmıştır. cpSSR markörleri genellikle 8-15 tekrarlı olan mononükleotidleri içerir. Kloroplast SSR markörlerinin hem türlere göre hemde incelenen bölgeye göre polimorfizm oranının değiştiği rapor edilmiştir. Kloroplast SSR markörlerini, çekirdek SSR markörlerinden ayıran iki özellik vardır. Bunlar;Kloroplast SSR kalıtımının tek ebeveynden olması ve bilinen tüm kloroplast SSR markörlerinin birbirleri ile bağlı olması ve rekombinasyonun olmamasıdır. Kloroplast mikrosatellitler; üreme sistemleri çalışmaları, polen yoluyla gen akış oranlarının tespiti, türler arası melezleme çalışmaları, genetik çeşitlilik ve filocoğrafik çalışmalarda etkili olarak kullanılmaktadır.

2.2.5.1. Mitokondriyal Mikrosatellit (mtSSR: mitochondrial Simple Sequence Repeat) Markörleri

Bitki mitokondri DNA’sı çok dinamiktir. Ökaryotlarda, mitokondriyal DNA’nın boyutunun 200 ile 2500 kb arasında değiştiği ve bu yapının farklı gruptaki tekrarlanan elementlerden ve intronlardan oluştuğu bilinmektedir. Bitkilerin sahip olduğu mitokondriyal, hayvanların sahip olduğu mitokondriyal DNA’dan daha büyük ve karmaşıktır. mtSSR markörlerinin evrimsel hızı yavaş olduğu için, bitki popualsyonu çalışmalarında kullanımı oldukça sınırlıdır.

mtSSR markörlerin özellikle genetik çeşitlilik ve evrimsel olayları anlama çalışmalarında, genellikle hem çekirdek SSR hemde kloroplast SSR markörleri kullanılması tavsiye edilmektedir.

2.2.6. Tek Nükleotid Polimorfizmi (SNP: Single Nucleotide Polymorphism)

SNP en basit tanımıyla iki birey arasındaki belli bir DNA parçası dizileri arasındaki tek baz farklılığı olarak ifade edilen, bitkilerin de dahil olduğu pek çok canlı türünde ortaya çıka bir varyasyondur. SNP markörleri ya transisyonlar veya transversiyonlar gibi baz değişimlerini içermektedir. G>A ve C>T trasnsisyonları, insan genomundaki SNP’lerin %25’ini oluşturmaktadır. Tek nükleotid bilinen en düşük kalıtım yapısı olduğundan dolayı bu markör sistemi hem basit hem de yüzlerce markörün elde edilmesine olanak sağlar. SNP markörleri tüm canlılar aleminde olduça yoğun yoğun olarak bulunmaktadır. Bitkilerde her 100-300 baz çifti uzunluğundaki DNA parçasında 1 SNP olduğu rapor edilmiştir. Bir bitki populasyonunda tek baz değişiminin frekansı %1’den büyük ise bu değişim SNP, %1’den küçük ise mutasyon olarak adlandırılır. SNP markörleri bitki genomunun tüm bölgelerine yayılmış olup hem kodlanan hemde kodlanmayan bölgelerinde farklı yoğunlukta bulunurlar. Genomik DNA’nın yapısal elementleri ve fonksiyonel etkinlikleri göz önünde bulundurularak SNP’ler birkaç farklı sınıfa ayrılabilir. Bunlar SNP pozisyonuna bağlı olarak;

• Ekzon SNP (eSNP)
• İntron SNP (iSNP)
• Promotor SNP (pSNP)

SNP markörlerinin bitkilerde genotiplenmesiyle ilgili olarak oldukça farklı analiz tipleri geliştirilmiştir. Özellikle SNP temelli genotip tanımlanmasında kullanılan DNA çipleri ve allel-spesifik PCR analizleri, aynı anda birden fazla markörü analiz etmesi ve otomasyona uygunluğu açısından olumlu yönleri olarak dikkat çekmektedir.

SNP markörlerinin avantajları genel olarak iki başlık altında toplanabilir. Bunlar;

• SNP markörlerinin sınırsız sayıda olması
• SNP analizlerinin jel elektroforeze dayalı olmaması ve otomasyona uygun olmasıdır.

SNP markörleri günümüzde bitki ıslahının tüm alanlarında yoğun olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda SNP’lerin belirlenmesinde Kompetitif Allel Spesifik PCR (KASP) markörleri yoğun olarak kullanılmaktadır. KASP bilinen tek nükleotid polimorfizmlerin ve insersiyon/delesyondan kaynaklanan polimorfizmlerin (InDel) bi-allelik ayrımlarını doğru ve kesin bir biçimde ortaya koyan floresan destekli ve PCR temelli bir genotipleme yaklaşımıdır.

2.2.6. Transpozon DNA Markörleri

Transpozonlar, genom üzerinde kendilerini bir konumdan başka bir konuma aktarma yeteniğine (transpozisyon) sahip olan DNA dizileridir. İnsan da dahil olmak üzere bütün ökaryotik organizmalarda transpozonlar belirlenmiş ve genom içerisinde önemli yapılardan biri oldukları gösterilmiştir. Trasnpozonlar sahip oldukları mekanizma sayesinde içinde bulundukları genoma dinamik bir yapı kazandırarak genetik varyasyonun oluşmasına dolalı/dolaysız olarak katkıda bulunurlar.

Transpozonlar, replikasyon mekanizmalarına göre iki ana grup altında toplanırla. Bunlar;

• DNA transpozonları : Transpozisyon mekanizması sadece DNA’da gerçekleşir.
• RNA transpozonları (retrotranspozon): Önce RNA ara formu olarak transkribe edilen transpozon sonra ter-transkripsiyon ile DNA ara formuna dönüşür ve genomik DNA’ya entegra olur.

2.2.6.1. Retrotranspozonlar Arası Çoğaltılmış Polimorfizm (IRAP: Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism)

IRAP, bir retrotranspozon tipi markördür. Çok lokuslu dominant bir markör tekniğidir. Bu teknikte PCR reaksiyonları ya tek primer ya da iki primer kullanılarak yapılır. Elde edilen PCR ürünleri agaroz jel ile ayrılır. Bu yöntemin en önemli avantajı, herhangi bir kesim enziminin ve radyoaktifin kullanılmamasıdır. Ancak her bir örnek için elde edilen bant sayısı fazla olduğu için sistemin her bitki grubu için; özellikle PCR koşulları ve DNA konsantrasyonunun optimize edilmesi gerekmektedir.

2.2.6.2. Retrotranspozon Mikrosatellit Çoğaltılmış Polimorfizm (REMAP: Retrotransposon Microsatellite Amplified Polymorphism)

REMAP, genetik çeşitlilik çalışmalarında yoğun olarak kullanılan dominant ve multipleks bir DNA markör sistemidir. Bu markör yönteminin protokolü IRAP’a benzemektedir. Ancak bu markör sisteminde hem bir uzun terminal tekrar (LTR: Long Terminal Repeat) primeri hem de yakınındaki bir mikrosatellit spesifik bir primer kullanılmaktadır. Bu nedenle bir LTR ve bir miksrosatellit arasındaki bölgeler çoğaltılır. REMAP yönteminde kullanılan mikrosatellit primerleri tekrar motiflerinin iki tarafını da çevreleyen bölgelere yapışan orijinal SSR primerlerinden faklıdır. Diğer bir ifadeyle, bir LTR primeri SSR’ın kendisini içeren primer ile kombine olur. PCR şartları ve PCR ürünlerinin analizi IRAP yöntemine benzerdir.

2.2.6.3. Primerler Arası Bağlanma Yeri (iPBS: inter-Primer Binding Site)

Geliştirilen tüm retrotranspozon DNA markörleri için LTR bölgelerinin dizi bilgileri gerekli olup bu durum oldukça büyük bir problem yaratır. Özellikle bu bilginin elde edilmesi için, üzerinde çalışılan bitki genomundan LTR bölgelesinin klonlanması ve dizilenmesi gerekir. Bu problemleri ortadan kaldırmak için retrotranspozonların primer bağlanma yeri (PBS: Primer Binding Site) bölgeleri kullanılmıştır. Bu teknikteki amaç 5′ uçları karşılıklı olarak hızlanmış iki farklı retrotranspozonun arasındaki bölgenin çoğaltılması olup üniversal olan birçok primer geliştirilmiştir. Bu yöntem geliştirildikten sonra birçok bitki grubunda genetik çeşitlilik çalışmalarında başarılı bir şekilde kullanılmıştır.

2.2.7. Dizine Karakterize Edilmiş Çoğaltılmış Bölgeler (SCARs: Sequence Characterized Amplified Regions)

Hem RAPD DNA markör sisteminde yaşanan olumsuzlukları ortadan kaldırmak hem de ko-dominant bir markör geliştirmek için ortaya konulmuş bir tekniktir. Bu markör, RAPD’ye göre hem oldukça güvenilir hem de tekrarlanabilirliği oldukça yüksek bir markördür. SCAR markörlerinin geliştirilmesinde RAPD, AFLP vb. gibi çoklu band profilleri veren DNA markörleri ilk önce kullanılır. Bu DNA markörleri sonucu istenilen özellikle ilişkili olduğu düşünülen bant, agaroz veya poliakrilamid jelde belirlendikten sonra, farklı tekniklerle izole edilir ve dizilenir. Bu dizi bilgisine göre SCAR primerleri geliştirilir ve sistemin çalışıp çalışmadığına bakılır. Bu yöntemle birçok bitki türünde hem türleri ayırt etmede kullanılabilecek hem de marköre dayalı seleksiyon ıslahında kullanılabilecek DNA markörleri geliştirilmiştir.

2.2.8. Kesilmiş Çoğaltılmış Polimorfik Dizin (CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)

CAPS, genom içerisindeki belli bölgeleri uygun primerler kullnarak PCR ile çoğaltma, elde edilen PCR ürününü kesici enzimlerle kesme ve bu ürünü agaroz veya poliakrilamid jelde yürütmeye dayanmakta olup aynı zamanda PCR-RFLP olarakda adlandırılmaktadır. Özellikle DNA üzerinde meydana gelen SNP gibi tek nükleotid değişimleri, DNA üzerinde eklenme-silinmeler (InDel) yaptığı için kesici enzimlerin tanıdığı bölgeleri değiştirmekte ve bu durumda farklı uzunlukta DNA parçalarının oluşmasına neden olmaktadır.

CAPS markörleri, ko-dominant, lokusa özgü, az miktarda DNA’ya ihtiyaç duyması ve homozigot heterozigot alleleri ayırmaları nedeni ile farklı alanlarda kendine kullanım alanı bulmaktadır.

2.2.9. DNA Dizi Analizleri (DNA Sequencing)

İlk dizi analizi, 1960’ların başında 75-80 nükleotidi kapsayan küçük tRNA’ların tanımlanması ile başlamıştır. İlk yıllarda DNA dizi analizinin yapılması oldukça zor ve zaman alıcı olduğundan dolayı DNA’da bulunan nükleotid dizilerinin belirlenmesinde iki temel yöntem geliştirilmiştir. Bunlar;

• Maxam-Gilbert kimyasal degasyon
• Sanger dideoksi enzimatik yöntemidir.

Bunlar birinci nesil dizileme yöntemi olarak bilinmektedir. Bugün DNA’nın dizilenmesi, yeni geliştirilen yöntemler ve sistemler yardımıyla otomatik olarak kolay, doğru ve kısa bir süre içinde yapılabilmektedir. Elde edilen bu dizi bilgileri bitki ıslahında amaca uygun olarak yoğun olarak kullanılmaktadır.

2.2.9.1. Dizileme Aracılığla Genotipleme (GBS: Genotyping- by Sequencing)

Dizilemeyle genotipleme yeni nesil dizileme protokollerinin kullanılmasıyla hızlı bir şekilde SNP markörlerinin bitki genomunda belirlenmesini salamakta olup, son yıllarda en çok kullanılan yöntemlerden birisi durumundadır. Kısaca GBS, bir genotipe ait genomun kesici enzimlerle kesilmesi ve elde edilen DNA parçalarının dizilenmesi prensibine dayanır. Özellikle bitki ıslahında genomik seleksiyonda bu yöntem yoğun olarak kullanılmaktadır.

GBS tekniği genetik çeşitlilik belirlenmesi, genetik haritalama ve QTL analizleri gibi çalışmalarda son yıllarda yoğun olarak kullanılmatadır.

2.2.9.2. Çeşitlilik Dizin Teknolojisi (DArT: Diversity Arrays Technology, DArt-Seq: Diversity Arrays Technology-Sequencing )

Bu teknik bir bitki genomunun tüm kısmını kapsayan ve hızlı bir şekilde polimorfik lokusların belirlenmesinde kullanılmaktadır. DArT, prensip olarak tekrarlanabilir bir mikroarray melezleme teknolojisine sahiptir. Düşük maliyetli yöntem olan DArT ile yapılan genetik markör analizlerinde az miktarda DNA örneği (50-100 ng) ile herhangi bir DNA dizi bilgisi bulunmayan organizmalarda bile, tüm genomu kapsayan yüksek çözünürlüklü sonuç elde edilmektedir. DArT genomda düşük kopya sayısına sahip bölgeleri hedeflemekte olup, otomasyona uygun bir yöntemdir. Bu tekniğin en cazip yönü, hızlı bir şekilde yüzlerce bitkiyi ekonomik olarak analiz edebilmesidir.

Moleküler Markörlerin Bitkilerde Kullanımı

Moleküler markörler bitki çalışmalarında kullanılmaktadır. Bunlar;

• Evrim ve akrabalık ilişkileri (filogeni) çalışmaları
• Heterosis (melez gücü) araştırmaları
• Haploid/Diploid bitkilerin tanımlanması ve çeşit genotiplemesi
• Genetik çeşitlilik belirlemesi
• Genetik bağlantı haritası oluşturması
• Kantitatif özellik lokuslarının (QTL) haritalanması
• İlişkilendirme haritalanması
• Marköre dayalı seçim
• Genin geri melezleme ile ticari çeşide aktarılması (İntrogresyon)
• Genomik seçim ve genom çapında ilişkilendirme şeklindedir.

Kaynakça:

• Yelda Özden Çiftçi, Ahu Altınkut Uncuoğlu, 2019, Bitki Biyoteknolojisinde Güncel Yaklaşımlar, Palme, Ankara, ISBN: 9786052823040 
• C. Neal Stewart Jr. (Editor), Plant Biotechnology and Genetics: Principles, Techniques, and Applications, 2nd Edition, ISBN: 978-1-118-82012-4, March 2016