AGAROZ JEL ELEKTROFOREZ SİSTEMİ

1) ELEKTROFOREZ TANKI

Jelin ve yürütme tamponunun konulduğu kısımdır (Şekil 6).

Şekil 6. Elektroforez tankı

2) GÜÇ KAYNAĞI

DNA örneklerinin jel üzerinde yürümesi için elektrik akımını sağlar (Şekil 7).

Şekil 7. Güç kaynağı

3) JEL DÖKME TEPSİLERİ

Jelin döküldüğü ve tarakların takıldığı kısımdır (Şekil 8).

Şekil 8. Jel dökme tepsisi

4) TARAKLAR

Jel tepsisine dökülen jele takılırlar ve jel donduğunda çıkarılırlar. Böylece jel üzerinde DNA örneklerinin yükleneceği kuyucuklar oluştururlar (Şekil 9).

Şekil 9. Jel elektroforezinde kullanılan tarak çeşitleri

5) AGAROZ

Agaroz, bir kırmızı alg türü olan Agar agar’dan izole edilen doğrusal bir polisakkarittir. Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman polimerde karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur. Bu oluşum geri dönüşümlüdür. Agaroz konsantrasyonu % 0,5 – 3 arasında değiştirilerek jelin por çapı ayarlanabilir (Şekil 3). Böylece, küçük DNA fragmentleri için yüksek, büyük DNA fragmentleri için düşük agaroz konsantrasyonu kullanılarak DNA’nın jelde en uygun şekilde yürümesi sağlanır (Şekil 10).

Şekil 10. Agaroz konsantrasyonu yapıalcak deneye göre belirlenir.

Deniz yosunundan ekstrakte edilen doğal bir kolloit olan agaroz, galaktoz ve 3,6-anhidrogalaktoz ünitelerinin ardışık olarak yer aldığı agarobioz ünitelerinin tekrarlanmasından oluşan ve moleküler kütlesi yaklaşık 12.000 Da olan lineer bir polisakkarittir. Agaroz çok hassastır ve elle dokunulduğunda kolayca bozulabilir. Agaroz jel kuru toz halindeki agarozun berrak bir çözeltiye dönüşene kadar kaynatılmasıyla oluşturulur. Daha sonra bu çözelti jel tepsisine dökülür. Ve oda sıcaklığında katılaşıncaya kadar soğutulur. Katılaştıktan sonra yoğunluğu agaroz konsantrasyonuyla belirlenen bir matris oluşturur.

Jeldeki agaroz konsantrasyonu fazla olduğunda porların çapı küçülür. Bundan dolayı büyük moleküller daha yavaş hareket ederler. Ve jelde görüntüleri geride kalmış şekilde görünür. Agaroz konsantrasyonu az olduğunda porların çapı büyür. Bundan dolayı küçük moleküller daha hızlı hareket ederler. Ve jelde en önde görünürler. Agaroz jel elektroforezinde daha önde olan moleküllerin boyutu daha küçüktür, çünkü porlardan molekül boyutu büyük olanlara göre daha hızlı ve kolay ilerlerler.

6) YÜRÜTME TAMPONLARI

DNA’nın elektroforetik hareketliliği elektroforez tamponunun kompozisyonuna ve iyonik gücüne göre değişir. İyonların yokluğunda, elektrik iletimi en düşük düzeydedir ve DNA çok yavaş hareket eder yahut hiç etmez. Yüksek iyonik güçlü bir tamponda ise elektrik iletimi çok verimlidir fakat önemli miktarda ısı oluşur. En kötü durumda bu ısı sebebi ile jel erir ve DNA denatüre olur.

Doğal çift zincirli DNA elektroforezinde kullanılan bir takım tamponlar mevcuttur. Bunlar genellikle EDTA (pH 8,0) ve yaklaşık 50 mM (pH: 7,5-7,8) konsantrasyonunda Tris-Asetat-EDTA (TAE), Tris-Borat-EDTA (TBE) veya Tris-Fosfat-EDTA (TPE) içerir. Elekroforez tamponları genellikle konsantre solüsyonlar olarak hazırlanır ve oda sıcaklığında saklanır. TBE, agaroz jel elektoroforezi için başlangıçta 1X çalışma gücünde kullanılmıştır. Ancak, 0,5X çalışma solüsyonu yeterince fazla tamponlama kapasitesine sahiptir ve artık hemen hemen tüm agaroz jel elektroforezleri bu tampon konsantrasyonu kullanılarak yapılmaktadır.

6.1) TBE TAMPONU

Hem akrilamid hem de agaroz jel elektroforezi esnasında yaygın olarak kullanılır. DNA pürifikasyonu ve DNA sekanslama teknikleri için optimize edilmiştir. Toz halinde, konsantre sıvı halde, kullanıma hazır konsantrasyonda ya da tablet halinde bulunabilir. Tabi en uygunu ve ucuzu kendimizin hazırlamasıdır.

• Küçük DNA fragmanlarının yüksek rezolüsyonda ayrımında kullanılır.
• 1 kb DNA ayrıştırmada faydalıdır.
• Tampon kapasitesi TAE tamponundan yüksektir.
• Uzun süreli elektroforezler için uygundur.
• Yüksek iyonik güçe sahip.
• Tamponun tekrar sirkülasyonuna gerek yoktur.

6.2) TAE TAMPONU

Yüksek moleküler ağırlıkta, DNA’nın yüksek rezolasyonda gerektiren agaroz jel elektroforez uygulamalarında yoğun olarak kullanılır. TAE tamponu jel içi manipülasyonları ve bant izolasyonları prosedürlerinde TBE tamponuna göre daha kullanışlıdır.

• DNA’nın jelden ayrıştırılmasında ve jel içi manipülasyonlarda uygundur.
• Büyük DNA fragmanlarının daha iyi rezolüsyonunu verir.
• 12 kb DNA ayrıştırılmasında uygundur.
• Düşük tamponlama kapasitesine sahiptir.
• Düşük iyonik güce sahiptir.
• Tamponun tekrar sirkülasyonu gerekli olabilir.

7) YÜKLEME TAMPONU (LOADING BUFFER)

Öncelikle agaroz jele yüklenecek DNA örnekleri, genellikle su, sukroz ve bir boyadan oluşan yükleme tamponuyla karıştırılır. Yükleme tamponuna sukrozun konulma amacı, molekül ağırlığından dolayı DNA’nın kuyulara çökmesini sağlamaktır ve inert madde olup DNA ile tepkimeye girmez. Boya konulmasının amacı ise DNA örneklerini jele yüklerken görünür olmasını sağlar ve araştımacıya kolaylık sağlar ayrıce jelde DNA hareket ederken DNA’nın görüntülemesi sağlar.

Şekil 11. Agaroz jel elektroforezinde kullanılan yükleme tamponları. Farklı renkelrde yükleme tamponları vardır. En çok kullanılanı bromofenol mavisidir.

Şekil 12. Yükleme tamponun kullanım aralıkları

Birçok yükleme tamponu vardır. Bu yükleme tamponlarının içeriği birbirinden farklıdır. İçindeki boya ve sukroz değişebilir. Sukroz yerine başka bir maddede kullanılabilir. Etidyum bromid ile boyanmış bir jelin fotoğrafıyla belirlenebilen minimum DNA miktarı, 0,5 cm genişliğinde bir bantta, 2 ng’dır. Bu genişlikteki bir bantta 500 ng’dan daha fazla DNA varsa kuyucuk aşırı yüklenecektir ve bu da bulanıklığa yol açacaktır.

Yükleme tamponunun üç görevi vardır: 

1. Örneğin yoğunluğu arttıracak DNA’nın kuyuya eşit bir şekilde yayılmasını sağlamak,
2. Örneğe renk katmak ve bu sayede yükleme işlemine basitleştirmek,
3. Elektrik alanında tahmin edilebilir bir hızda anoda doğru hareket eden örneğe renk vermek.

8) MARKÖR (MARKER) DNA

Belirli bir voltaj, agaroz jel ve tampon konsantrasyonu için hareket aralığı başlangıç materyalinin molekül ağırlığına bağlıdır. Bu yüzden belirli bir büyüklükteki markör DNA, jelin sağ ve sol yanlarındaki kuyucuklara yüklenmelidir. Genellikle bir markör DNA belirli sayıda, ağırlığı bilinen DNA parçaları içerir. Bu da elektroforez sırasında jel sistematik bir bozukluğa uğrarsa bilinmeyen DNA’ların büyüklüğünü saplamayı kolaylaştırır.

Şekil 13. Markör DNA belirli bir büyüklükte DNA parçaları içerir. DNA örnkeleriyle beraber jele yüklenen markör DNA, örneklerin uzunlukları hakkında bilgi verir.

9) AGAROZ JELDEKİ DNA’NIN BOYANMASI

Agaroz jel içindeki DNA’yı, görünür hale getirmenin en uygun yolu, fluoresan özellikteki Etidyum bromür boyasını kullanmaktır. Bu boya DNA’ya bağlanır ve UV ışığı altında fluoresan verir. Böylece jeldeki DNA bandı görünür hale gelir. Etidyum bromür kuvvetli bir mutajen ve oldukça toksiktir. Toksik olmasından dolayı mutajen olmayan RedSafe, GelRed gibi boyalarda kullanılmaktadır.

ETİDYUM BROMÜR’ÜN ETKİSİ

EtBr moleküller biyoloji laboratuvarlarında nükleik asitlerini fluoresan işaretlemekte kullanılır.

Şekil 14. EtBr yapısı

Bu molekül morötesi ışığa maruz kalınca turuncu renkte ışınır, DNA’ya bağlı olması halinde ışığın seviyesi 20 kat daha fazla olur. Jel elektroforezi gibi laboratuvar tekniklerinde DNA görüntülenmesinde etidyum bromürün bu özelliğinden yararlanılır. Etidyum bromür kuvvetli bir mutajendir.

Çoğu ışınır (fluoresan) bileşik gibi etidyum bromür de aromatiktir. Moleküler yapısının çekirdeğini oluşturan çok halkalı kısım, fenantridin olarak bilinir, bunun bir diğer türevi akridin adlı fluoresan boyadır. Etidyum bromürün DNA’ya bağlandıktan sonraki yoğun ışınırlığının (fluoresansının) nedeni fenil grubunun sabitleşmesi değildir, çünkü fenil halkasının enterkale olunan bazların düzlemine neredeyse dik durumda olduğu gösterilmiştir. Asıl nedenin, EtBr’nin arasına sıkıştığı bazlar arasındaki hidrofobik ortam olduğuna inanılmaktadır. Bu hidrofobik ortam içine giren etidyum katyonu kendisine ilişkili olan tüm su moleküllerinden sıyrılmak zorunda kalır. Su, etkili bir ışınırlık söndürücüsü (fluorescence quencher) olduğu için, su moleküllerin ayrışması etidyumun daha çok ışınmasına neden olur. Etidyum bromür laboratuvarda çift iplikçikli nükleik asitleri tespit etmek için yaygın olarak kullanılır. Nükleik asitler genelde bir agaroz jeli içinde elektroforezle ayrıştırılır, jel bir EtBr çözeltisi içinde bir süre bekletilince EtBr nükleik asitlerle kompleks oluşturur. Bunun ardından jel morötesi ışığa tutulur, fluoresan görüntü bir fotoğraf makinesi ile kaydedilir .

Morötesi ışık, gözler ve deriye zararlı olduğu için jelin fotoğrafı özel bir kutu içinde çekilir, eğer doğrudan jele bakmak gerekiyorsa kişinin göz ve derisinin korunması gerekir. Artık çoğu laboratuvar görüntü almak için kameralı UV’li jel görüntüleme sistemleri kullanmaktadır (Şekil 17-18).

Şekil 15. Otomatize olmayan jel görüntüleme sistemi. Jel cihaza koyulu, UV ışık açılır ve bantlara bakılır. Fotograf makinesiyle fotoğraflar çekilir.

Şekil 16. EtBr ile boyanmış agaroz jelin UV-transilluminator’daki görüntüsü

Şekil 17. Otomatize bir jel görüntüleme cihazı. Cihaz bilgisayara bağlanır ve bilgisayardan fotoğraf istenilen şekilde ayarlanarak çekilir ve yazıcıdan çıktı alınabilir.

Şekil 18. Otomatize jel görüntüleme sisteminden elde edilen agaroz jel elektroforezi sonucu

Bazı laboratuvarlarda jel hazırlanırken EtBr jele eklenir ondan sonra dondurulur. Bazı laboratuvarlarda ise DNA örnekleri yürütüldükten sonra EtBr tampon içinde jel bekletilir daha sonra görüntü alınır.

Şekil 19. DNA zincirleri arasına girmiş bir EtBr molekülü

Kaynakça:

• C. Neal Stewart Jr. (Editor), Plant Biotechnology and Genetics: Principles, Techniques, and Applications, 2nd Edition, March 2016, ISBN: 978-1-118-82012-4
• Temizkan G. Yılmazer S. Öztürk M. Arı Ş. Ertan H. Sarıkaya A. Arda N. 2008. Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler. Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler: Genel Bakış/ DNA’nın İzolasyonu ve Analizi Sayfa:1-76
• Jel elektroforezi
• Jel elektroforezi-2
• Plazmit
• Genomik DNA
• EtBr