Jel elektroforezi, makromolekülleri büyüklük, elektrik yükü ve diğer fiziksel özellikler temelinde ayıran bir yöntemdir. Elektroforez terimi yüklü partiküllerin elektrik akımı etkisi altında hareketini açıklamaktadır. ‘Elektro’ elektriğe karşılık gelir, ‘forez’ anlamı karşıya geçirmek/taşımak olan Yunanca bir kelimedir. Jel elekroforezi elektrik varlığında hareketlenen moleküllerin jel boyunca karşıya hareket ettiği bir tekniği tanımlar. Bir elektrik alanının bir molekülü hangi hızla jel ortamında hareket ettirdiği, molekülün özelliklerine bağlıdır. Birçok önemli biyolojik makromolekül (örn. proteinler, nükleik asitler) iyonlaşabilen gruplara sahiptir ve pH’ya bağlı olarak çözeltide anyon (-) ya da katyon (+) biçiminde, elektrik yükü taşıyan türler olarak bulunurlar. Net yükün özelliğine bağlı olarak, yüklü partiküller katota veya anoda doğru hareket edecektir. Örneğin, elektrik alanının uygulandığı jel nötral pH’da ise, DNA’nın negatif yüklü fosfat grupları anoda doğru hareket eder. DNA moleküllerinin analizinde çok çeşitli yöntemler kullanılmakla beraber tüm laboratuvarda rutin olarak yararlanılan en basit yöntemlerden biri jel elektroforezidir.

Yöntemin avantajları basit ve hızlı olması, ayrıca diğer yöntemlerle yeterli düzeyde ayrılamayan DNA fragmentlerinin ayrılabilmesini sağlamasıdır. UV ışığı altında fluoresan etki gösteren etidyum bromür (EtBr) boyasının kullanımı ile çok düşük konsantrasyonlarda olsa bile, DNA’nın jel üzerindeki yerini belirlemek mümkündür.

Agaroz jelde DNA’nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün elektriksel bir alanda, jel üzerindeki göçüne dayanır (Şekil 1). Bu göç hızını molekülün büyüklüğüne, yapısına, jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.

Jel elektroforezinde kullanılan destekleyici madde (matriks) mekaniksel etkiyi engellemek ve molekülleri büyüklüklerine göre ayırmak için kullanılır. Matriks nişasta, poliakramid, agaroz veya agaroz-akrilamid karışımı olabilir. Geliştirilmiş elektroforez teknikleri içinde nükleik asitler için en çok kullanılanı agaroz jel elektroforezidir.

Şekil 1. Agaroz jel elektroforezi sistemi

Elektroforez, yüklü partiküllerin bir elektrik akımının etkisiyle birbirinden ayrılması işlemidir. Elektroforez, elektriksel bir alanda moleküllerin yüklerine, moleküler ağırlıklarına ve büyüklüklerine göre ayırt edildikleri bir tekniktir. Elektroforetik analizin temeli, moleküllerin elektriksel bir alanda jel üzerindeki göçüne dayanır. Bu göç hızı molekülün büyüklüğüne, yapısına, jeldeki kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.

Elektroforezin çalışma ilkesi; molekül ağırlığı ve molekülde bulunan elektrik enerjisinin jel içinden bir yükten diğerine giderken yol aldığı mesafe farklılıklarını ele almaktır. Elektroforezde yol alınan mesafe, net yük ile doğru; molekül büyüklüğü ve elektroforetik ortamın viskozitesi ile ters orantılıdır.

Elektroforez için dört şeye ihtiyaç vardır.

1. İyonların hareket edebileceği uygun bir ortam ( elektroforetik destek ortamı, jel).
2. Uygun pH’da bir tampon çözelti (TBE, TAE).
3. Elektriksel alanı oluşturmak için doğru akım sağlayacak güç kaynağı.
4. Birbirinden ayrılan bantların kantitatif olarak değerlendirebilen dansitometri ve bantları görüntülemek için UV cihazı.

Elektroforetik destek ortam, elektrot bölmeleri arasına yerleştirilir. Elektroforetik desteğe uygulanan numune (DNA, RNA), akım uygulandığında göç edecektir. Elektroforetik destek ortamda numuneler ilerdeikten sonra ölçüm aşamasına geçilir ve analiz yapılır. Bu aşamada ya dansitometri ya da UV cihazı kullanılır. Hangisinin kullanılacağı araştırmacıya bağlıdır.

Dansitometri absorbans ölçümüdür ve destek ortamdaki boyanın absorbansını ölçer. Dansitometrenin temel bileşenlerini; ışık kaynağı, monokromatör, tüm plağın taranması için hareketli bir taşıyıcı, optik sistem ve fotodetektör oluşturur.

ELEKTROFOREZ YÖNTEMLERİ

• Poliakrilamid Jel Elektroforezi
• Agaroz Jel Elektroforezi
• Değişen Alanlı Jel Elektroforezi
• İzoelektrik Odaklanma
• İki Boyutlu Elektroforez
• Kılcal Elektroforez

AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ

Agaroz jel elektroforezi DNA moleküllerinin ayrımı, tanımlanması ve saflaştırılması için kullanılan standart bir yöntemdir. Bu teknik basit, hızlı ve diğer prosedürlerle ayrıştırılamayan DNA fragmanlarını ayırabilme yeteneğindedir. Ayrıca DNA’nın jeldeki konumunu, düşük konsantrasyonlarda fluoresan ışıma veren EtBr ile boyanarak belirlemek mümkündür. EtBr dışında başka boyalarda kullanılmaktadır.

DNA’NIN ELEKTROFORETİK GÖÇ ORANINI ETKİLEYEN FAKTÖRLER

1) DNA’NIN MOLEKÜL BÜYÜKLÜĞÜ

Büyük DNA molekülleri jeldeki küçük porlardan geçerken engellenir. Böylece büyük DNA fragmentleri küçük DNA fragmentlerinden daha yavaş hareket eder. Elektroforez sonucunda büyük DNA fragmentleri küçük DNA fragmentlerine göre yükleme kuyusuna daha yakın konumda olacaktır (Şekil 2).

Şekil 2. Agaroz jele yüklenen DNA örneklerinden boyutu büyük olan daha yukarıda yer alırken daha kısa DNA dizileri daha ileride yer alır.

2) AGAROZ KONSANTRASYONU

Belirli bir büyüklükteki DNA fragmenti agaroz (farklı konsantrasyonlarını içeren) jeller boyunca farklı oranlarda göç eder. Düşük agaroz konsantrasyonu büyük DNA’ların ayrılmasını sağlarken, yüksek agaroz konsantrasyonu küçük DNA’ların ayrılmasını kolaylaştırır. Şekil 3’te olduğu gibi %2’lik agaroz jelin por çapı daha küçük olacağından büyük DNA küçük DNA’ya göre daha yavaş ilerleyecektir ve arkadan gelecektir. DNA böylelikle boyutuna (uzunluğuna) göre bantlar verecektir (Şekil 2).

Şekil 3: Agaroz konsantrasyonu jelin por çapını belirler. Por çapıda DNA’nın hareketini belirler.

Agaroz konsantrasyonunu DNA boyutuna göre belirleyebiliriz:

• %0.7’lik Agaroz jel: 10-15kb’den daha büyük DNA fragmanlarının ayrımı için kullanılabilir.
• %1’lik Agaroz jel: 0,5-1kb baz çifti uzunluğundaki DNA fragmanlarının ayrımı için kullanılabilir.
• %2’lik Agaroz jel : 0,1–1kb’den küçük DNA fragmanlarının ayrımı için kullanılabilir.
• %3’lik Agaroz jel : Çok küçük DNA fragmanlarının ayrımı için kullanılabilir. Bu genelde dikey poliakrilamid jel için daha uygundur.

3) DNA’NIN KONFORMASYONU

DNA’nın genomik (Şekil 5) ya da plazmid DNA’sı (Şekil 4)olmasına göre jeldeki görünümleri farklılık gösterir.

Şekil 4. Plazmit DNA’nın agaroz jeldeki görüntüsü. Bakteride bulunan plazmit formlarından dolayı farklı bant boyutları görülür. Bakteriden plazmit izolasyonu yapılıp örnekler jele yüklenirse iki bant görülür. Şekilde restriksiyon enzimiyle kesilmiş plazmitte yer almaktadır. Enzim kesim bölgesi arttıkça bant sayısıda artacaktır.

Şekil 5. Genomik DNA’nın agaroz jeldeki görüntüsü. Genomik DNA çok büyük olduğundan jelde çok hızlı hareket edemez ve kuyuya yakın konumda yer alır.

4) UYGULANAN AKIM

Düşük voltajda lineer DNA fragmentlerinin göç oranı uygulanan voltajla orantılıdır. Elektriksel alan gücü arttırılırsa büyük fragmentlerin göçü küçük fragmentlere göre oransal olarak artar. DNA fragmentlerinin maksimum ayrılmasını sağlamak için jeller düşük akımda koşturulmalıdır.

5) ELEKTROFOREZ TAMPONLARI

DNA’nın elektroforetik hareketliliği tamponun kompozisyonuna ve iyonik gücüne göre değişir. Tamponun yerine yanlışlıkla su kullanılırsa jelde DNA göçü olmaz. Aynı şekilde konsantre tampon kullanılırsa jelde fazla miktarda ısı üretilir ve böylece jel erir.

AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİNİN FİZİKSEL ÖZELLİKLERİ

Jel elektroforezi nükleik asitlerin ve proteinlerin ayrılması için kullanılan bir tekniktir. Makromoleküllerin ayrılması iki değişkene bağlıdır; yük ve kütle. DNA gibi biyolojik bir örnek bir tampon çözeltiye karıştırıldığı ve jele uyguladığı zaman bu iki değişken birlikte rol oynar. Bir elektrottan (katot) gelen elektrik akımı, molekülleri iterken aynı anda diğer elektrot (anot) molekülleri kendine doğru çeker. Jeldeki sürtünme kaynaklı ayrım gücü molekülleri büyüklüklerine göre ayırarak ‘moleküler elek’ görevi yapar. Elektroforez sırasında makromoleküller, jelin porlarından hareket etmeye zorlanır.

Elektrik alanı altında hareket oranları şu faktörlere bağlıdır:

• Alan gücü
• Moleküllerin büyüklüğü ve şekli
• Örneklerin göreceli hidrofobisitesi
• Moleküllerin içinde hareket ettiği tamponun iyonik kuvveti ve sıcaklığı

Moleküllerin büyüklüklerine göre ayrılabilme özellikleri, jel elektroforezinin pek çok amaç için kullanımına olanak sağlamıştır. Agaroz jel elektoroforez tekniği, moleküler genetik alanında da önemli bir deneysel sistem oluşturmaktadır. Agaroz sıcak suda çözünür, soğutulduğu zaman, karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur. Bu oluşum geri dönüşümlüdür. Ticari olarak satılan bazı agarozlar tamamen saf olmayıp, diğer polisakkaritler, tuzlar ve proteinlerle birlikte bulunabilir. Bu kirliliklerin oranı, hem DNA’nın jeldeki hareketini etkiler, hem de elektroforezin yanlış sonuçlanmasına neden olabilir.