Gerçek Zamanlı Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu, RT-QPCR

(Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-QPCR)

   1988 yılında “Thermus aquaticus” bakterisinden saflaştırılan, ısıya dayanıklı polimerazın (Taq polimeraz) kullanımı ile Polimeraz Zincir Reaksiyonları için (PCR) otomatize termal döngü cihazları geliştirilmeye başlanmıştır.

   RT-QPCR, nükleik asit çoğalmasıyla eş zamanlı olarak artış gösteren floresan sinyalinin ölçülmesiyle, kısa sürede kantitatif sonuç verebilen bir PCR yöntemidir. Gen anlatımının analizini değiştiren bu metot ile geleneksel PCR yöntemi ve gen analizi birleştirilmiştir. PCR çoğaltımını görünür hale getiren ve monitorize edebilen floresan işaretli prob ve boyaların kullanıldığı, floresanın oluşan DNA ile doğru orantılı olarak arttığı bir çoğalma yöntemidir.

Sıcaklık döngüleri ve floresan okunması aynı cihaz içinde ve aynı tüp içinde gerçekleşmektedir. Böylece hedef bölge, elektroforeze gerek kalmadan kısa bir süre içinde saptanabilmektedir. Aynı cihaz içerisinde hem çoğaltma işleminin hem de çoğaltılan ürünleri saptama işleminin yapılabilmesi, bu yöntemi çok pratik bir yöntem haline getirmiştir. Ayrıca tüpler açılmadan test tamamlandığı için kontaminasyon riski de azalmaktadır.

Bu gelişim sayesinde artık gen kopya ürünlerinin düzeylerini sayısal değerlere dönüştürerek ölçmek, devam eden PCR reaksiyonunu ekranda izleyerek ‘Real Time’ (eşzamanlı) olarak reaksiyonun gidişine müdahale etmek ve PCR döngülerinin sayısıyla oynayabilmek de mümkündür.

Birçok adlandırmayla anılan bu teknolojiye floresan okuma yapması nedeniyle yabancı yayınlarda floresan kantitatif RT-PCR, kantitatif-kinetik PCR, homojen PCR ve kantitatif Real-Time PCR gibi çeşitli adlar altında rastlamak mümkündür.

   Gen ekspresyon seviyelerinin belirlenmesi çoğu moleküler biyoloji laboratuvarının temelini oluşturmaktadır. Hücresel RNA miktarını ölçerek, belirli bir genin ne kadar ifade edildiğini belirlenebilir. Birçok gen için, ekspresyon seviyeleri genden gene, hücreden hücreye veya çeşitli deneysel koşullar sırasında önemli ölçüde değişir. Bu yüzden RNA seviyelerinin doğru bir şekilde ölçülmesi ve yorumlanması gerekmektedir. RNA seviyelerini belirlemek için kullanılan yöntemlerden bir tanesi de RT-QPCR’dır.

RT-QPCR yapılmasını ve analizini bir örnek üzerinde inceleyelim. Diyelim ki insan kanser hücrelerine bir ilaç uyguladık ve bu ilacın kanser hücrelerini apoptoza soktuğunu düşünüyoruz. Bunu gen düzeyinde göstermek içinde apoptoz genlerinin seviyesine bakmak istiyoruz. Deneyin hücre kültürü kısmında kanser hücrelerine bu ilacı uyguluyoruz ve 72 saat sonra total RNA izolasyonu yapıyoruz. Total RNA izolasyonunu hem uygulama yaptığımız kanser hücrelerinden hem de uygulama yapmadığımız kanser hücresi kontrol grubundan yapıyoruz. İzole edilen total RNA örneklerimizde DNA kontaminasyonu varsa bu kontaminasyondan kurtulmak için ilk olarak bu örneklere DNaz enzimi uygulamamız gerekiyor (Şekil 1). 

Şekil 1. DNaz uygulaması örneği

   DNaz uygulamasında sonra bu total RNA’ları ters trankriptaz enzimi ile cDNA’ya çeviriyoruz (Şekil 2). 

Şekil 2. cDNA sentezi uygulaması

   cDNA sentezi yapıldıktan sonra bizim merak ettiğimiz gen apoptozla ilişkili Bax geni olsun. Bu gene spesifik RT-QPCR primerleri kullanarak her bir gen için ayrı RT-QPCR yapıyoruz. Aynı zamanda kontrol geni (Housekeeping gene) içinde RT-QPCR reaksiyonu kuruyoruz. Housekeeping gen olarak 18S rRNA, 7S rRNA, U6 RNA, β actin, GAPDH veya small nucleolar RNAs (snoRNAs) kullanılabilir. Daha sonra kurduğumuz RT-QPCR reaksiyonunu RT-QPCR cihazına yüklüyoruz ve döngü koşullarını cihaza giriyoruz. Döngü koşulları yapılan deneye ve kullanılan enzime bağlı olarak değişmektedir. Bunun için aşağıdaki tabloyu (Şekil 3) örnek olsun diye ekliyorum. 

Şekil 3. Kurulan reaksiyonun RT-QPCR cihazı için kullanılan döngü bilgileri

Cihaza örnekleri yüklüyoruz, döngüyü başlatıyoruz ve bitmesini bekliyoruz. Döngüler devam ederken ekranda gerçek zamanlı olarak döngüleri takip edebiliriz veya ek döngü ekleyebiliriz. RT-QPCR bittikten sonra cihaz bize C_T değerleri verecektir. Cihazdan her bir reaksiyon kuyucuğunun C_T değerlerini alıyoruz. 

Örnek olarak bu değerleri tabloda gösterip, ΔC_T, ΔΔC_T ve 2^-ΔΔC_T değerlerinin nasıl hesaplandığına bakalım. RT-QPCR sonucu örneklerden alınan C_T değerlerinin aşağıdaki tablodaki gibi olduğunu varsayalım. (Değerler gerçek değerler değildir ve daha anlaşılır olması açısından örnek olabilecek değerler verilmiştir.) Deneyde hem biyolojik tekrar hem de teknik tekrar sayısı 3 olarak alınmıştır. hGapdh housekeeping ve hBax genini bakmak istediğimiz apoptoz geni olarak seçelim.

Şekil 4. Örnek RT-QPCR CT değerleri

İlk olarak teknik tekrarların ortalamasını alıyoruz. Tabloda ORTALAMA olarak belirtilmiştir.

hGapdh: (16,65 + 16,64 + 16,64) / 3 = 16,653333

hBax: (26,22 + 26,25 + 26,28) / 3 = 26,25

Sonra hBax ortalamasından hGapdh ortalamasını çıkarıyoruz ve ΔC_T değerini buluyoruz.

hBax – hGapdh: 26,25 – 16,653333 = 9, 5966667

Normalize etmek için de uygulama yapılan örneklerin ΔC_T değerinden uygulama yapılmamış örneklerin ΔC_T değerinden çıkarıyoruz ve ΔΔC_T değerini bulmuş oluyoruz.

Uygulama ΔC_T – Uygulamama yapılmamış ΔC_T : 9, 5966667 – 20,17333333 = -10,57667

ΔΔC_T = -10,57667

2^-ΔΔC_T değerini bulmak içinde ΔΔC_T değerini formülde yerine yazıyoruz ve 2^-ΔΔC_T değerini bulmuş oluyoruz.

2^-ΔΔC_T : 2^-(-10,57667)= 1527,193

Böylelikle hBax geninin ilaç uygulaması yapılınca insan kanser hücrelerinde ekspresyon seviyesinin hGapdh genine göre ne kadar değiştiğini kantitatif olarak bulmuş oluyoruz. 

RT-QPCR tepkimesi nasıl gerçekleşmekte ve cihaz C_T değerlerini nasıl belirlemektedir? 

RT-QPCR da C_T değerini cihazın nasıl belirlediğini SYBR Green I üzerinden görelim.  SYBR Green I, çift zincirli DNA’ya (dsDNA) bağlanan floresan bir boyadır. dsDNA’nın küçük oluğuna bağlanır ve bağlandığı zaman floresan ışıma verir. Belli bir noktaya kadar PCR ile uyumludur, çok yüksek konsantrasyonlarda PCR reaksiyonunu inhibe etmeye başlar. 

SYBR Green I’in en büyük avantajı herhangi bir dsDNA’ya bağlanmasıdır; herhangi bir probun tasarlanması ve optimize edilmesi gerekmez. SYBR Green I’in en büyük dezavantajı, herhangi bir dsDNA’ya bağlanmasıdır; spesifik ürün, spesifik olmayan ürünler ve primer dimerleri eşit derecede tespit edilir. RT-QPCR reaksiyon ortamına enzim, primer ve tampon koyulurken SYBR Green I boyasıda eklenir. Bu boya genelde tamponun içinde kitle beraber hazır olarak satılmaktadır. Cihaz içerisinde amplifikasyonun başlangıcında, reaksiyon karışımı denatüre DNA, primerler ve boyayı içerir. Bağlı olmayan boya molekülleri zayıf bir şekilde floresan ışıma verir. Bu ışıma bilgisayar analizi sırasında çıkarılır. 

Şekil 5. Başlangıç reaksiyon ortamı

cDNA’ya bağlanacak spesifik primerlerin bağlanmasından sonra boya molekülü çift zincire bağlanır. cDNA-primer çifti arasına bağlanan SYBR Green I moleküllerinden yayılan floresan ışık dramatik bir artışla sonuçlanır.

Sonra polimeraz enzimi primere bağlanır ve uzama işlemini başlatır. Uzama sırasında, giderek daha fazla boya molekülü yeni sentezlenen dsDNA’ya bağlanır. Reaksiyon sürekli olarak izlenirse, gerçek zamanlı olarak da floresanda bir artış görülür. 

Şekil 6. Primerlerin bağlanmasıyla SYBR Green boyası çift zincir arasına girerek ışıma verir

dsDNA’nın bir sonraki denatürasyonunda çift zincir ayrılır, boya molekülleri salınır ve floresan sinyal düşer. Cihaz her PCR döngüsünün uzama aşamasının sonunda floresan ölçümü, artan amplifiye DNA miktarını izlemek için yapar.

Şekil 7. DNA polimeraz primere bağlanıp diziyi tamamladıkça daha çok SYBR Green bağlanır ve ışıma miktarı artar

RT-QPCR’dan sonra yapılan bir erime eğrisi analizi ile SYBR Green I boyası spesifik ürün tanımlaması ve miktar tayini için mükemmel bir araç sağlar. Cihaz bu erime eğrisinde C_T değerini belirler. 

Şekil 8. RT-QPCR cihazının oluşturduğu grafik

C_T değeri, örneğin reaksiyon eğrisinin eşik çizgisiyle kesiştiği PCR döngü numarasıdır. Bu değer, örneklerinizden gerçek bir sinyali saptamak için kaç döngü gerektiğini gösterir. RT-QPCR çalışmalarında her numune için bir reaksiyon eğrisi ve dolayısıyla birçok Ct değeri olacaktır. Kullanılan cihazın yazılımı, örneklerinizin her biri için C_T değerini hesaplar ve grafiğini çizer. Daha sonra C_T değerine göre gen ekspresyon analizi yukarıda anlatıldığı gibi yapılabilir.

   Eşik çizgisi (baseline), algılama seviyesidir. Yani bir reaksiyonun arka plan seviyelerinin üzerinde bir floresan yoğunluğuna ulaştığı noktadır. RT-QPCR yapmadan önce cihaz yazılımı bir eşik seviyesi ayarlar. Eşik çizgisi kelimenin tam anlamıyla, arka plan floresansının üzerinde bir seviyeyi temsil eden ve aynı zamanda üstel fazının başlangıcında bir yerde reaksiyon eğrinizi kesen bir çizgidir.

RT-QPCR primeri nasıl tasarlanmalıdır?

   Ekson-ekson primerleri cDNA’nın amplifikasyonu için spesifiktir, çünkü bunlar sadece ekson sekanslarına bağlanabilirler. Bu primerler ekson-ekson birleşimleri arasında intron içeren genomik DNA’ya bağlanamaz. RNA, DNA ile kontamine olmuş olabilir bu durumda örneklerinizde sadece istediğiniz cDNA yoktur genomik DNA’da mevcuttur. Bununla birlikte, ekson-ekson primerleri kullanarak sadece numunelerinizdeki cDNA miktarını analiz edersiniz. Ekson-ekson birleşim primerleri RT-QPCR’ınızda DNA amplifikasyonunu önleyecektir.

Şekil 9. RT-QPCR primeri seçilirken dikkat edilmesi gereken noktalar

   Deneye başlamadan önce geninizi eksprese eden bir örnekten RNA izole edip cDNA sentezlemeli ve primerlerinizi kontrol etmelisiniz. Yani pozitif kontrolünüz olmalı ve primerlerinizi bu pozitif kontrolle test edebilmelisiniz. Kontrol olarak beta-aktin, GADPH gibi bir ‘housekeeping’ geni hedefleyen primerlere de amplifikasyon yapılmalıdır.   Çalışmalarınızı RNA’dan arındırılmış ortamda yapmalısınız. Bunun için Nükleaz eliminatör kullanabilirsiniz.

Reverse Transcription PCR (RT-PCR) ve Real-Time Quantitative (RT-QPCR) arasındaki fark nedir?

   RT-PCR terimi Ters Transkripsiyon PCR için kullanılmaktadır. RT-PCR da PCR reaksiyonundaki başlangıç genetik materyali RNA’dır. RNA ilk olarak ters transkriptaz enzimi ile komplementer DNA (cDNA)’ya çevrilir. Daha sonra cDNA PCR ile çoğaltılır ve agaroz jele yüklenir. Agaroz jel elektoroforezi kullanılarak çoğaltılan gen ürününün varlığı veya yokluğuna bakılır. Sayısal veri almak isteyen bazı araştırmacılar agaroz jeldeki bant parlaklığını ölçerek sayısal veri olarak gen yoğunluğunu belirtirler.

Daha anlaşılır olması açısından örnek bir RT-PCR çalışması tasarlayalım. Diyelim ki kanser hücrelerine bir ilaç uyguladık ve bu ilacın kanser hücrelerini apoptoza soktuğunu düşünüyoruz. Bunu gen düzeyinde göstermek içinde apoptoz genlerinin seviyesine bakmamız lazım. Deneyde kanser hücrelerine bu ilacı uyguladık ve 72 saat sonra total RNA izolasyonu yaptık. Total RNA izolasyonunu hem uygulama yaptığımız hücrelerden hem de uygulama yapmadığımız kontrol grubundan yapıyoruz. Daha sonra bu total RNA’ları ters trankriptaz enzimi ile cDNA’ya çeviriyoruz. cDNA havuzu içerisinde benim merak ettiğim gen apoptozla ilişkili Bcl2 ve Bax genleri olsun. Bu genlere spesifik primerler kullanarak her bir gen için ayrı PCR yapıyoruz. Eğer Bcl2 ve Bax genleri aktif hale gelmişse primerlerim bu genlere spesifik olduğundan PCR sonucu bu genlerimde çoğalmış ürün beklerim. PCR yaptıktan sonra her bir PCR’ı agaroz jelde ayrı kuyucuklara yüklüyoruz ve yürütüyoruz. Daha sonra kontrol uygulama yapılmış hücreler ile kontrol grubumun bantlarını karşılaştırıyorum. Eğer kontrol grubunda bant yok ise ve uygulama grubumda bant görürsem, bu ilacın kanser hücrelerini apoptoza sürüklediğini söyleyebilirim. RT-QPCR ise RT-PCR’dan farklıdır.

RT-QPCR’da kullanılan prob sistemleri ve boyalar nelerdir?

RT-QPCR da sadece SYBR Green I boyası kullanılmaz. Çalışmaya göre kullanılacak prob ve boya farklılık göstermektedir. Genel olarak bunlar iki ye ayrılmaktadır.

A. Özgül Floresan İşaretli Problar

• FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
• Taqman
• Molecular Beacons
• Scorpion Primerleri
• Hibridizasyon Probları

B. Özgül Olmayan Floresan İşaretli Problar

• Syber Green I
• Etidyum Bromid

RT-QPCR genel kullanım alanları nelerdir?

• Gen ekspresyonunun kantitasyonu
• Patojenlerin tespiti
• DNA hasarı (mikrosatellit instabilitesi) tespiti 
• Protein seviyelerinin validasyonu: bir genin transkripsiyon derecesinin bir validasyonu olarak
• Sağlıklı duruma kıyasla hastalıklı durumdaki bir genin ekspresyonundaki farkı incelemek
• Hücre farklılaşması veya gelişimi sırasında gen ekspresyonunda değişiklikleri belirlemek
• Kimyasal bir maddeye (örneğin ilaç, toksin, hormon veya sitokin) maruz kalan hücreler için ekspresyon değişikliğini belirlemek
• Kodlayıcı olmayan RNA gen ekspresyonunun miktarının belirlenmesi

Referanslar:

• Schmittgen, T., Livak, K. Analyzing real-time PCR data by the comparative C_T method. Nat Protoc 3, 1101–1108 (2008). https://doi.org/10.1038/nprot.2008.73
• Farell EM, Alexandre G. Bovine serum albumin further enhances the effects of organic solvents on increased yield of polymerase chain reaction of GC-rich templates. BMC Res Notes. 2012;5:257. Published 2012 May 24. doi:10.1186/1756-0500-5-257
• Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402‐408. doi:10.1006/meth.2001.1262
• RT-QPCR
• Primer
• Temel bilgiler