cDNA (tamamlayıcı DNA) nedir?
Tamamlayıcı DNA, komplementer DNA veya cDNA, ters transkriptaz enzimiyle katalizlenen bir reaksiyonda şablon olarak kullanılan olgun bir mRNA'dan sentezlenen DNA parçasına verilen addır. cDNA sentezinde kullandığımız malzemelerin ne işe yaradığını bilirsek bu reaksiyonun nasıl gerçekleştiğini daha kolay anlayabiliriz. Bunun için ilk olarak cDNA sentezi için kullanılan malzemelere bakalım. Bu malzemeler farklı marka kitlere göre değişmektedir. Bu yazıda genel olarak kullanılan malzemelerin ne amaçla kullanıldığından bahsedileceğim.
- Ters transkriptaze enzimi (Reverse Transcriptase)
Tek iplikli bir RNA molekülünü kalıp olarak kullanıp tek iplikli DNA üreten bir DNA polimeraz enzimidir. Ayrıca RNA’nın tek iplikli cDNA şeklinde okunduktan sonra çift iplikli DNA oluşmasında da görev alır.
- Tampon
Tampon kullandığımız enzimin çalışması için gerekli ortamı sağlar. Tamponlar, enzimlerin deney sırasında istenen pH’yı oluşturması için kullanılır. Aynı zamanda enzimi stabilize etme görevi görür.
- dNTPs
cDNA sentezi için gerekli organik bazlardır. İçerisinde adenin (dATP), sitozin (dCTP), guanin (dGTP) ve timin (dTTP) bulunmaktadır. cDNA oluşturulurken ters transkriptaz enzimi RNA dizisinin karşısına Watson-Crick baz eşleşmesine uygun bazı ekler.
- DTT (Dithiothreitol)
DTT, PCR reaksiyonlarında stabilize edici reaktif olarak kullanılmaktadır. Birçok protein (ve hatta DNA) serbest (bağlanmamış) sülfhidril (-SH) gruplarına sahiptir. Bu bağlı olmayan gruplar, topaklar (aggregate) oluşumuna yol açacak diğer bağlı olmayan -SH gruplarıyla etkileşime girme eğilimindedir. Kısacası, proteinler topaklar oluşturur ve inaktif hale gelir. DTT, proteinin serbest –SH gruplarıyla etkileşime girer ve böylece diğer proteinlerle etkileşmesini önler. Sonuç olarak DTT proteini stabilize eder ve aktif bir konformasyonda tutar. DTT aynı zamanda RNA’nın ikincil yapısını gevşetir ve transkripsiyonun ters transkriptaz enzimi tarafında başlatılmasını kolaylaştıracak bağların (disülfür bağları) kırılmasına yardımcı olur.
- BSA (Bovine serum albumin)
BSA, düşük saflıktaki ürünlerin, GC açısından zengin (GC> %60) ürünlerin, ikincil yapılar içeren kalıpların bulunduğu, düşük verime sahip, reaksiyonun bağlanma özgüllüğünün zayıf olduğu durumlarda hibridizasyonu arttırmak, fenolik bileşikler gibi potansiyel inhibitörleri içeren ürünlerin PCR amplifikasyonun kolaylaştırılmasında ve PCR veriminin arttırılmasında kullanılır. Ayrıca enzimlerin reaksiyon tüplerine ve pipetin uç yüzeylerine yapışmasını önler.
- Rastgele Heksamer Primerleri (Random primers)
Rastgele heksamer primerleri, olası tüm heksamer dizilerini temsil eden oligonükleotidlerin karışımından oluşur.
Şekil 1. Rastgele heksamer primeri dizisi
Rastgele heksamer primerleri, tek iplikli DNA veya RNA’nın DNA polimerazlar veya ters transkriptazlar tarafından uzatılması için yaygın olarak kullanılır. Genellikle 6 nükleotid uzunluğunda olduklarından, genellikle rastgele hekzamerler olarak bilinirler. cDNA üretimi sırasında rastgele bağlanarak, çeşitli uzunluklarda cDNA içeren bir cDNA havuzu oluşturmak için RNA’nın tüm bölgelerine rastgele bağlanma sağlar.
Şekil 2. Rastgele heksamer primerinin bağlanması
Rastgele bağlanma, mRNA ile reaksiyonda bulunan diğer RNA türleri arasında ayrım yapmaz hepsine bağlanır. Rastgele hekzamer primerleri ve oligo (dT) karışımı, cDNA sentezinin duyarlılığını arttırabilir.
- Oligo (dT) primerleri
Oligo (dT) primerleri, deoksitimidin uzantılarından oluşur. Çeşitli uzunluklarda mevcutturlar, en yaygın olanı 12-18 nükleotit uzunluğundadır. Oligo (dT) primerleri, haberci RNA’nın (mRNA) tamamlayıcı poli (A) kuyruklarına bağlanacak şekilde tasarlanmıştır.
Şekil 3. Oligo (dT) primerinin bağlanması
Bu nedenle, oligo (dT) ler sadece mRNA’lar hedeflendiğinde cDNA reaksiyonlarında faydalıdır. 18S rRNA gibi poliA mRNA olmayan fragmanlara bağlanmaz.
- Sekansa Spesifik Primerler
Sekansa spesifik primerler, yalnızca ilgilenilen bölgeyi dönüştürecek benzersiz primerler kullanıldığından, ilgilenilen hedef için en büyük spesifikliği sağlar.
Şekil 4. Sekansa spesifik primerin bağlanması
Bazı cDNA sentez kitlerinde tek zincirli cDNA üretilirken bazı cDNA kitleri çift zincirli cDNA zinciri üretir. Ters transkriptaze tek zincirli cDNA üretiminde kullanılır. Bunun için reaksiyon ortamına RNA’yı degrede eden enzimler (RNaz H vb.) eklenerek cDNA sentezlenirken aynı zamanda RNA degrede edilir. Sonuç olarak tek zincirli cDNA oluşmuş olur.
Şekil 5. cDNA sentezi sırasında RNA’nın RNazH tarafından kesilmesi ve parçalanması
Bazen de alkali ortam sağlanarak çift zincirli cDNA tek zincirli cDNA’ya dönüştürülür.
Şekil 6. Alkali ortamda tek zincirli cDNA sentezi
Bazı deneylerde cDNA plazmide aktarılmak istenmektedir. Bunun içinde tek zincirli cDNA DNA polimeraz kullanılarak çift zincirli hale getirilip plazmite aktarılabilir.
Şekil 7. Plazmite aktarılmak istenen cDNA’nın sentezlenmesi
Yapılan çalışmaya göre cDNA sentezi farklı protokoller içermektedir. Yapılacak çalışmaya göre uygun cDNA sentezi gerçekleştirilmelidir.
Kaynaklar: