Cas9, seçilen bir DNA hedef bölgesini kesmek için yönlendirilebilen, RNA kılavuzlu bir endonükleazdır. Hedef DNA’nın kesilmesi için kısa bir protospacer-bitişik motifin (PAM) yanı sıra, Cas9 ile ilişkili kılavuz RNA (gRNA) ve hedef bölge arasında tamamlayıcılık gerekir (Şekil 1). 

Şekil 1. Cas9 enziminin hedef DNA’yı PAM dizisinden tanıması ve çift zincir kırığı oluşturması. HNH ve RuvC enzimin kesim yaptığı domainleridir. sgRNA ise Cas9’ı hedefe spesifik dizi bilgisini taşımaktadır.

CRISPR-Cas9 sistemi bakterilerin savunma sistemi olduğundan farklı bakterilerin farklı Cas9 proteinleri vardır (Şekil 2).

Şekil 2. Farklı bakterilere ait Cas9 enziminin yapıları

Cas9 proteini gRNA ile hedef bölgeye yönlendirilir ve hedef DNA’nın çift zincirini keser. Bu sistemin spesifik olması araştırmacılar için iyi bir özelliktir. Fakat bazı araştırmacılar Cas9 enziminin kesim özelliğini istemediğinden Cas9 proteinini mutasyona uğratarak endonükleaz aktivitesini inhibe etmişlerdir. Oluşturulan Cas9 enzimine dead Cas9 veya deactivated Cas9 olarak isimlendirmişlerdir. Kısaltmasını dCas9 olarak belirlemişlerdir. dCas9 DNA ya bağlanma özelliğine sahiptir sadece nükleaz aktivitesini kaybetmiştir. Cas9 enziminde mutasyon 10. ve 840. Amino asitlerde meydana gelmiştir. Bu mutasyonlar aşağıdaki şekildede gösterilmiştir. D10A ve H840A mutasyonları nükleaz aktivitesini kaybetmesine neden olmuştur (Şekil 3).

Şekil 3. Cas9 enziminde domainleri ve mutasyona uğratılan D10 ve H840 amino asitleri. a. Cas9 enzimin domainleri, b. RucC doamininde meydana getirilen D10 mutasyonu, c. HNH domaininde meydana getirilen H840 mutasyonu

dCas9 varyantları daha sonra VP64, P300, KRAB gibi efektör domainleriyle birleştirilmiştir. Araştırmacılar belirli bir gen aktivitesini sağlamak için (gen aktivasyonu, gen basklanma vb.) dCas9’ı genom içinde istedikleri herhangi bir yere yönlendirmiştir. Bu gelişmelerle birlikte CRISPR-dCas9 aktivasyon sistemi de yapılan çalışmalarla gelişmektedir.

Referanslar:

• Fuguo Jiang and Jennifer A. Doudna, CRISPR–Cas9 Structures and Mechanisms, Annual Review of Biophysics 2017 46:1, 505-529. https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-062215-010822

• Chavez, A., Tuttle, M., Pruitt, B. et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nat Methods 13, 563–567 (2016). https://doi.org/10.1038/nmeth.3871