DNA ve RNA izolasyonunda kullanılan kimyasallar ve amaçları nelerdir?
Günümüzde DNA ve RNA izolasyonu için birçok laboratuvar hazır kit kullanmaktadır. Kit hem pratiktir hem de kısa bir sürede DNA veya RNA elde etmenizi sağlar. Ama öğrenci laboratuvarlarında ve bazı laboratuvarlarda hala DNA veya RNA izolasyonu kit kullanılmadan manuel olarak yapılmaktadır.
Kitsiz yapılan DNA veya RNA izolasyon protokolleri laboratuvara ve DNA veya RNA'sı izole dilecek canlıya-dokuya göre farklılık göstermektedir. Protokollerin çoğunda aşağıda bahsedilecek olan kimyasallar kullanılmaktadır. Bu kimyasallardan bazıları DNA/RNA izolasyon kitlerinin içerisinde de bulunmaktadır. Fakat şirketler kit içeriklerini kimyasal olarak değil solüsyonlar şeklinde hazırlayıp kite eklemektedir. Bu solüsyonlar A solüsyonu (veya tamponu), B solüsyonu (veya tamponu) vb. şeklinde olduğundan direkt olarak solüsyonun (veya tamponun) içinde ne olduğunu belirtmezler. Sadece hangi solüsyondan (veya tampondan) hangi aşamada ne kadar kullanmanız gerektiğini belirtirler. Ama temel mantık her zaman aynıdır.
DNA izole edilecekse sıralama şöyledir:
- Hücrelerin parçalanması (Liziz)
- Protein ve RNA’nın ortamdan uzaklaştırılması (Pürifikasyon)
- DNA’nın yoğunlaştırılması ve çöktürülmesi (Presipitasyon)
- DNA’nın yıkanması ve elde edilmesi
- DNA’nın kalite ve saflığının tespiti
RNA izole edilecekse sıralama şöyledir:
- Hücrelerin parçalanması (Liziz)
- Protein ve DNA’nın ortamdan uzaklaştırılması (Pürifikasyon)
- RNA’nın yoğunlaştırılması ve çöktürülmesi (Presipitasyon)
- RNA’nın yıkanması ve elde edilmesi
- RNA’nın kalite ve saflığının tespiti
DNA ve RNA izolasyonunda kullanılan kimyasalların kullanım amaçları şu şekildedir:
a) Lizozim: Bakteri hücre duvarındaki peptidoglikan tabakanın oluşmasını sağlayan β-1,4-glikozidik bağlarını kırarak hücre duvarını parçalar. Bunu da β-1,4-glikozidik bağları hidroliz ederek yapar.
b) SDS (Sodyum dodesil sülfat): Anyonik bir deterjandır. Uygun pH koşullarında zardaki protein ve lipoproteinlerle etkileşime girerek onları uzaklaştırır. Ortamdaki lipid (yağ) moleküllerini parçalar (liziz eder), uzaklaştırır ve böylece hücre membran yapısını bozar.
c) EDTA (Etilen diamin tetraasetik asit): +2 yüklü elementleri (Mg+2, Mn+2, Fe+2) kendine bağlar, membran yapısını zayıflatır. DNaz’lardaki kofaktörleri bağlayarak, DNA’nın parçalanmasını önler. Ayrıca lipopolisakkarid moleküllerini birbirine bağlayan Ca+2 iyonlarının ortamdan çekilmesini sağlamakta ve böylece lizozimin içteki peptidoglikan tabakasına ulaşımını kolaylaştırmaktadır.
d) Selülaz: Bitkilerin hücre duvarını parçalar. Bunu selülozun β-1,4-glikozidik bağlarını parçalayarak yapar.
e) Proteinaz K: Membrandaki proteinlerin parçalanmasını sağlar. Peptit bağlarına etki eder. SDS ya da diğer denatüre edici ajanlara karşı (üre gibi) hassas olmadığı için kullanılır. Proteinaz-K DNA’ya bağlı olan proteinleride (ökromatin yapısındaki/histonlar vb.) parçalayarak DNA’nın serbest kalmasını sağlar.
f) Fenol: Proteinleri denatüre eder, yapısını çözer ve ortamdan uzaklaştır. Proteinlerin sekonder yapısını parçalayarak onların denatüre olmasını ve solüsyonda presipitasyonu sağlarlar.
g) %70’lik Etanol: Katyonların varlığında DNA’yı çöktürür. Bunu da fosfat grupları ile pozitif iyonlar sayesinde güçlü bir bağ oluşturur ve DNA’yı çökertir.
h) RNaz: RNA'daki nükleotitler arasındaki fosfodiester bağlarını hidrolize ederek RNA’yı parçalar.
ı) Soğuk etanol: DNA soğuk etanol içerisinde çözünmez. Soğuk etanol DNA’daki zayıf hidrojen bağlarıyla etkileşime girerek kinetiği azaltır ve DNA’yı çökmesini sağlar.
j) STE (Sodyum Tris EDTA): Ardından koyulacak enzimlerin çalışabileceği uygun pH ortamını hazırlamaktadır.
k) Kloroform: İzoamil alkol (C:I): Ortamdan fenolü uzaklaştırır ve lipidleri denatüre ederek çökmesini sağlar. Ayrıca kloroform organik fazlar arasındaki dayanıklı olmayan bağları stabilize eder. İzoamil alkol ise ara fazın stabilizasyonuna katkı sağlar ve aynı zamanda kabarcık oluşumunun önlenmesine yardım eder. Sıvı (şeffaf) fazda DNA, organik fazda lipit, protein ve diğer safsızlıklar yer alır.
l) TE (Tris-EDTA): DNA, TE tamponu içerisinde çözünür. Bu sayede DNA’nın uzun süre bozulmadan saklanmasını sağlar.
m) Amonyum asetat: Etanol varlığında DNA’nın çökmesine yardımcı olur. (DNA konsantrasyonuna bağlı olarak) Tuz DNA’nın negatif yükünün nötralize olmasına yardım eder (böylece çözücü moleküllerden ayrılır- bu durumda çözücü sudur). Tuz aynı zamanda su ile etkileşime girerek DNA’nın çözünürlüğünü zayıflatır ve DNA’yı çöktürür. Bu ‘salting out’ olarak bilinir.
n) Sodyum asetat: DNA’daki (–) yüklü fosfat gruplarıyla etkileşime girerek DNA’yı çöktürür.
o) İzopropanol: DNA’yı çöktürür. Bu çözücü içinde RNA da stabil kalabilir (seçici çöktürme). %50’den daha çok izopropanol varlığında DNA çökelti halinde kalır.
p) Sodyumklorür (NaCl): Hipotonik ortam sağlayarak tüm hücreleri patlatır. Tuzun etkisi suyu uzaklaştırmak şeklindedir, bu ise protein-protein arasındaki etkiyi artırarak çökmeye neden olur.
r) Sorbitol: Ekstraksiyonda müsligin polisakkaritlerin olması viskositeyi arttırır, sorbitol bundan kurtulmak için kullanılır. Yumuşayan bitki materyali, ekstraksiyonu kolaylaştıran sorbitol tamponuyla yıkanır. Diğer protokollere göre en kaliteli DNA'yı verdiği gösterilmiştir.
s) Tween: Non iyonik deterjandır. Protein-protein, lipit-lipit etkileşimlerini kırar. Daha çok yıkama amaçlı kullanılır. Memeli hücrelerini liziz eder, membran proteinlerini çözer.
t) Triton X: Non iyonik deterjandır. Hücre membran bütünlüğünü bozar ve hücreyi liziz eder. Proteinleri çöktürmede kullanılır.
u) CTAB: Yüksek iyonik kuvvetli ortamda protein ve polisakkaritleri çötürür, nükleik asitleri çöktürmez.
ü) PVP (Polyvinylpyrolidone): Fenolik bileşikleri uzaklaştırmak için kullanılır.
v) βME (beta mercapto etanol): Taninleri (polifenolik bileşikler) ve ham bitki ekstraktında bulunan polifenolleri uzaklaştırır.
y) LiCl: Seçici olarak RNA'yı çöktürür.
z) KAc: DNA'nın çökelmesini sağlar.
w) %100 Etanol: DNA'yı yıkamak için kullanılır.
İzole edilen DNA;
- Günlük saklamalarda +4 oC
- Uzun süreli saklamarda -20 oC
- Daha uzun süreli saklamalarda -80 oC tercih edilmelidir.
İzole edilen DNA'nın saflık ölçümleri gerekli cihazlar (NanoDrop, BioDrop, Spektrofotometre vb.) kullanılarak yapılır.
DNA saflığı: A260/A280 = 1,8 olmalıdır.
RNA saflığı: A260/A280 = 2,0 olmalıdır.
Merak ettiğiniz diğer kimyasalları yorum kısmına yazarsanız, yazıya onları da ekleyebilirim.